Dankie dat u nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u die nuutste blaaierweergawe gebruik (of die versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Daarbenewens, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal hierdie webwerf vry van style en JavaScript wees.
Skeletspier is 'n heterogene weefsel wat hoofsaaklik uit miofibrille bestaan, wat by mense tipies in drie tipes geklassifiseer word: een "stadig" (tipe 1) en twee "vinnig" (tipes 2A en 2X). Heterogeniteit tussen en binne tradisionele miofibriltipes bly egter steeds swak verstaan. Ons het transkriptomiese en proteomiese benaderings toegepas op onderskeidelik 1050 en 1038 individuele miofibrille van die menslike vastus lateralis. Die proteomiese studie het mans ingesluit, en die transkriptomiese studie het 10 mans en 2 vroue ingesluit. Benewens miosien-swaarketting-isovorme, het ons metaboliese proteïene, ribosomale proteïene en sellulêre aansluitingsproteïene geïdentifiseer as bronne van multidimensionele intermiofibril-variabiliteit. Verder, ten spyte van die identifisering van trosse stadige en vinnige vesels, dui ons data daarop dat tipe 2X-vesels fenotipies ononderskeibaar is van ander vinnig-sametrekkende vesels. Verder is miosien-swaarketting-gebaseerde klassifikasie onvoldoende om die mioveselfenotipe in nemaliene miopatieë te beskryf. Oor die algemeen dui ons data op multidimensionele miovesel-heterogeniteit, met bronne van variasie wat verder strek as miosien-swaarketting-isovorme.
Sellulêre heterogeniteit is 'n inherente kenmerk van alle biologiese stelsels, wat selle toelaat om te spesialiseer om aan die verskillende behoeftes van weefsels en selle te voldoen.1 Die tradisionele siening van skeletspierveselheterogeniteit was dat motorneurone die veseltipe binne 'n motoriese eenheid definieer, en dat veseltipe (d.w.s. tipe 1, tipe 2A en tipe 2X in mense) bepaal word deur die eienskappe van miosien-swaarketting (MYH) isovorme.2 Dit was aanvanklik gebaseer op hul pH ATPase-onstabiliteit,3,4 en later op hul molekulêre uitdrukking van MYH.5 Met die identifisering en daaropvolgende aanvaarding van "gemengde" vesels wat veelvuldige MYH's in verskillende verhoudings saam uitdruk, word skeletspiervesels egter toenemend as 'n kontinuum beskou eerder as afsonderlike veseltipes.6 Ten spyte hiervan, steun die veld steeds sterk op MYH as die primêre klassifiseerder vir mioveselklassifikasie, 'n siening wat waarskynlik beïnvloed word deur die beperkings en beduidende vooroordele van vroeë knaagdierstudies waarvan die MYH-uitdrukkingsprofiele en reeks veseltipes verskil van dié in mense.2 Die situasie word verder bemoeilik deur die feit dat verskillende menslike skeletspiere 'n diverse reeks veseltipes vertoon.7 Die vastus lateralis is 'n gemengde spier met 'n intermediêre (en dus verteenwoordigende) MYH-ekspressieprofiel.7 Verder maak die gemak van monsterneming dit die beste bestudeerde spier in mense.
Dus, onbevooroordeelde ondersoek van skeletspierveseldiversiteit met behulp van kragtige "omika"-instrumente is krities, maar ook uitdagend, deels as gevolg van die multinukleêre aard van skeletspiervesels. Transkriptomika8,9 en proteomika10 tegnologieë het egter die afgelope paar jaar 'n revolusie in sensitiwiteit ondergaan as gevolg van verskeie tegnologiese vooruitgang, wat die analise van skeletspiere met enkelveselresolusie moontlik maak. Gevolglik is beduidende vordering gemaak met die karakterisering van enkelveseldiversiteit en hul reaksie op atrofiese stimuli en veroudering11,12,13,14,15,16,17,18. Dit is belangrik dat hierdie tegnologiese vooruitgang kliniese toepassings het, wat meer gedetailleerde en presiese karakterisering van siekte-geassosieerde disregulering moontlik maak. Byvoorbeeld, die patofisiologie van nemalienmipatie, een van die mees algemene oorgeërfde spiersiektes (MIM 605355 en MIM 161800), is kompleks en verwarrend.19,20 Daarom kan 'n beter karakterisering van die disregulering van skeletspiervesels lei tot beduidende vooruitgang in ons begrip van hierdie siekte.
Ons het metodes ontwikkel vir transkriptomiese en proteomiese analise van enkele skeletspiervesels wat handmatig uit menslike biopsie-monsters geïsoleer is en dit op duisende vesels toegepas het, wat ons in staat stel om die sellulêre heterogeniteit van menslike skeletspiervesels te ondersoek. In die loop van hierdie werk het ons die krag van transkriptomiese en proteomiese fenotipering van spiervesels gedemonstreer en metaboliese, ribosomale en sellulêre aansluitingsproteïene as belangrike bronne van intervesel-variasie geïdentifiseer. Verder het ons deur hierdie proteomiese werkvloei die kliniese relevansie van nematode-miopatie in enkele skeletspiervesels te gebruik, gekarakteriseer, wat 'n gekoördineerde verskuiwing na nie-oksidatiewe vesels onafhanklik van veseltipe gebaseer op MYH aan die lig gebring het.
Om die heterogeniteit van menslike skeletspiervesels te ondersoek, het ons twee werkvloeie ontwikkel om transkriptoom- en proteoomanalise van enkele skeletspiervesels moontlik te maak (Figuur 1A en Aanvullende Figuur 1A). Ons het verskeie metodologiese stappe ontwikkel en geoptimaliseer, van monsterberging en bewaring van RNA- en proteïenintegriteit tot die optimalisering van deurset vir elke benadering. Vir transkriptoomanalise is dit bereik deur monsterspesifieke molekulêre strepieskodes by die aanvanklike stap van omgekeerde transkripsie in te voeg, wat 96 vesels toegelaat het om vir doeltreffende stroomafverwerking saamgevoeg te word. Dieper volgordebepaling (±1 miljoen lesings per vesel) in vergelyking met tradisionele enkelselbenaderings het die transkriptoomdata verder verryk. 21 Vir proteomika het ons 'n kort chromatografiese gradiënt (21 minute) gekombineer met DIA-PASEF-data-insameling op 'n timsTOF-massaspektrometer gebruik om proteoomdiepte te optimaliseer terwyl hoë deurset gehandhaaf word. 22,23 Om die heterogeniteit van gesonde skeletspiervesels te ondersoek, het ons die transkriptome van 1 050 individuele vesels van 14 gesonde volwasse skenkers en die proteome van 1 038 vesels van 5 gesonde volwasse skenkers gekarakteriseer (Aanvullende Tabel 1). In hierdie artikel word hierdie datastelle onderskeidelik die 1 000-vesel transkriptome en proteome genoem. Ons benadering het 'n totaal van 27 237 transkripte en 2 983 proteïene in die 1 000-vesel transkriptomiese en proteomiese ontledings opgespoor (Figuur 1A, Aanvullende Datastelle 1-2). Nadat die transkriptomiese en proteomiese datastelle vir >1 000 opgespoorde gene en 50% geldige waardes per vesel gefiltreer is, is daaropvolgende bioinformatika-ontledings uitgevoer vir onderskeidelik 925 en 974 vesels in die transkriptome en proteoom. Na filtrering is 'n gemiddeld van 4257 ± 1557 gene en 2015 ± 234 proteïene (gemiddeld ± SD) per vesel opgespoor, met beperkte inter-individuele variasie (Aanvullende Figure 1B–C, Aanvullende Datastelle 3–4). Binne-subjek-variasie was egter meer prominent oor deelnemers, waarskynlik as gevolg van verskille in RNA/proteïen-opbrengs tussen vesels van verskillende lengtes en dwarssnit-areas. Vir die meeste proteïene (>2000) was die koëffisiënt van variasie onder 20% (Aanvullende Figuur 1D). Beide metodes het die vaslegging van 'n wye dinamiese reeks transkripsies en proteïene met hoogs uitgedrukte handtekeninge wat belangrik is vir spiersametrekking (bv. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) moontlik gemaak (Aanvullende Figure 1E–F). Die meeste van die geïdentifiseerde kenmerke was algemeen tussen die transkriptomiese en proteomiese datastelle (Aanvullende Figuur 1G), en die gemiddelde UMI/LFQ-intensiteite van hierdie kenmerke was redelik goed gekorreleer (r = 0.52) (Aanvullende Figuur 1H).
Transkriptomika- en proteomika-werkvloei (geskep met BioRender.com). BD Dinamiese reekskrommes vir MYH7, MYH2 en MYH1, en berekende drempels vir veseltipetoewysing. E, F Verspreiding van MYH-uitdrukking oor vesels in transkriptomika- en proteomika-datastelle. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP)-plotte vir transkriptomika en proteomika gekleur volgens MYH-gebaseerde veseltipe. I, J Kenmerkplotte wat MYH7-, MYH2- en MYH1-uitdrukking in transkriptomika- en proteomika-datastelle toon.
Ons het aanvanklik gepoog om MYH-gebaseerde veseltipe aan elke vesel toe te ken deur 'n geoptimaliseerde benadering te gebruik wat voordeel trek uit die hoë sensitiwiteit en dinamiese omvang van MYH-uitdrukking in omika-datastelle. Vorige studies het arbitrêre drempels gebruik om vesels as suiwer tipe 1, tipe 2A, tipe 2X of gemeng te etiketteer gebaseer op 'n vaste persentasie uitdrukking van verskillende MYH's11,14,24. Ons het 'n ander benadering gebruik waarin die uitdrukking van elke vesel gerangskik is volgens die MYH's wat ons gebruik het om die vesels te tipeer: MYH7, MYH2 en MYH1, wat ooreenstem met onderskeidelik tipe 1-, tipe 2A- en tipe 2X-vesels. Ons het toe wiskundig die onderste buigpunt van elke resulterende kurwe bereken en dit as 'n drempel gebruik om vesels as positief (bo die drempel) of negatief (onder die drempel) vir elke MYH toe te ken (Figuur 1B–D). Hierdie data toon dat MYH7 (Figuur 1B) en MYH2 (Figuur 1C) meer duidelike aan/af-uitdrukkingsprofiele op die RNA-vlak het in vergelyking met die proteïenvlak. Inderdaad, op proteïenvlak het baie min vesels nie MYH7 uitgedruk nie, en geen vesel het 100% MYH2-uitdrukking gehad nie. Ons het vervolgens voorafbepaalde uitdrukkingsdrempels gebruik om MYH-gebaseerde veseltipes aan alle vesels in elke datastel toe te ken. Byvoorbeeld, MYH7+/MYH2-/MYH1- vesels is aan tipe 1 toegeken, terwyl MYH7-/MYH2+/MYH1+ vesels aan gemengde tipe 2A/2X toegeken is (sien Aanvullende Tabel 2 vir 'n volledige beskrywing). Deur alle vesels saam te voeg, het ons 'n merkwaardig soortgelyke verspreiding van MYH-gebaseerde veseltipes op beide die RNA- (Figuur 1E) en proteïen- (Figuur 1F) vlakke waargeneem, terwyl die relatiewe samestelling van MYH-gebaseerde veseltipes tussen individue gewissel het, soos verwag (Aanvullende Figuur 2A). Die meeste vesels is geklassifiseer as óf suiwer tipe 1 (34–35%) óf tipe 2A (36–38%), hoewel 'n beduidende aantal gemengde tipe 2A/2X vesels ook opgespoor is (16–19%). 'n Opvallende verskil is dat suiwer tipe 2X-vesels slegs op RNA-vlak opgespoor kon word, maar nie op proteïenvlak nie, wat daarop dui dat vinnige MYH-uitdrukking ten minste gedeeltelik post-transkripsioneel gereguleer word.
Ons het ons proteomika-gebaseerde MYH-veseltiperingsmetode gevalideer deur middel van teenliggaam-gebaseerde dot blotting, en beide metodes het 100% ooreenstemming behaal in die identifisering van suiwer tipe 1- en tipe 2A-vesels (sien Aanvullende Figuur 2B). Die proteomika-gebaseerde benadering was egter meer sensitief, meer doeltreffend in die identifisering van gemengde vesels, en die kwantifisering van die proporsie van elke MYH-geen in elke vesel. Hierdie data demonstreer die doeltreffendheid van die gebruik van 'n objektiewe, hoogs sensitiewe omika-gebaseerde benadering om skeletspierveseltipes te karakteriseer.
Ons het toe die gekombineerde inligting wat deur transkriptomika en proteomika verskaf is, gebruik om miovesels objektief te klassifiseer gebaseer op hul volledige transkriptoom of proteoom. Deur die uniforme veelvuldige benadering en projeksie (UMAP) metode te gebruik om die dimensionaliteit tot ses hoofkomponente te verminder (Aanvullende Figure 3A-B), kon ons miovesel-variasie in die transkriptoom (Figuur 1G) en proteoom (Figuur 1H) visualiseer. Dit is opmerklik dat miovesels nie gegroepeer is volgens deelnemers (Aanvullende Figure 3C-D) of toetsdae (Aanvullende Figuur 3E) in óf die transkriptomika- óf proteomika-datastelle nie, wat daarop dui dat binne-subjek-variasie in skeletspiervesels hoër is as tussen-subjek-variasie. In die UMAP-plot het twee afsonderlike groepe wat "vinnige" en "stadige" miovesels verteenwoordig, na vore gekom (Figure 1G-H). MYH7+ (stadige) miovesels was by die positiewe pool van UMAP1 gegroepeer, terwyl MYH2+ en MYH1+ (vinnige) miovesels by die negatiewe pool van UMAP1 gegroepeer was (Figure 1I–J). Geen onderskeid is egter gemaak tussen vinnig-sametrekkende veseltipes (d.w.s. tipe 2A, tipe 2X, of gemengde 2A/2X) gebaseer op MYH-uitdrukking nie, wat daarop dui dat MYH1 (Figuur 1I–J) of ander klassieke 2X mioveselmerkers soos ACTN3 of MYLK2 (Aanvullende Figure 4A–B) uitdrukking nie onderskei tussen verskillende mioveseltipes wanneer die hele transkriptom of proteoom oorweeg word nie. Boonop, in vergelyking met MYH2 en MYH7, was min transkripte of proteïene positief gekorreleer met MYH1 (Aanvullende Fig. 4C–H), wat daarop dui dat MYH1-oorvloed nie die mioveseltranskriptom/proteoom ten volle weerspieël nie. Soortgelyke gevolgtrekkings is bereik toe die gemengde uitdrukking van die drie MYH-isovorme op die UMAP-vlak beoordeel is (Aanvullende Fig. 4I-J). Dus, terwyl 2X-vesels op die transkripsievlak geïdentifiseer kan word gebaseer op MYH-kwantifisering alleen, is MYH1+-vesels nie onderskeibaar van ander vinnige vesels wanneer die hele transkriptoom of proteoom oorweeg word nie.
As 'n aanvanklike ondersoek na stadige veselheterogeniteit buite MYH, het ons vier gevestigde stadige veseltipe-spesifieke proteïene geassesseer: TPM3, TNNT1, MYL3 en ATP2A22. Stadige veselsubtipes het hoë, hoewel nie perfekte, Pearson-korrelasies met MYH7 in beide transkriptomika (Aanvullende Figuur 5A) en proteomika (Aanvullende Figuur 5B) getoon. Ongeveer 25% en 33% van stadige vesels is nie as suiwer stadige vesels geklassifiseer deur alle geen/proteïensubtipes in transkriptomika (Aanvullende Figuur 5C) en proteomika (Aanvullende Figuur 5D) onderskeidelik nie. Daarom bring stadige veselklassifikasie gebaseer op veelvuldige geen/proteïensubtipes addisionele kompleksiteit mee, selfs vir proteïene wat bekend is as veseltipe-spesifiek. Dit dui daarop dat veselklassifikasie gebaseer op isovorme van 'n enkele geen/proteïenfamilie moontlik nie die ware heterogeniteit van skeletspiervesels voldoende weerspieël nie.
Om die fenotipiese veranderlikheid van menslike skeletspiervesels op die skaal van die hele omika-model verder te ondersoek, het ons onbevooroordeelde dimensionaliteitsvermindering van die data uitgevoer met behulp van hoofkomponentanalise (PCA) (Figuur 2A). Soortgelyk aan UMAP-grafieke, het nóg die deelnemer nóg die toetsdag veselgroepering op die PCA-vlak beïnvloed (Aanvullende Figure 6A–C). In beide datastelle is MYH-gebaseerde veseltipe verduidelik deur PC2, wat 'n groep stadig-sametrekkende tipe 1-vesels en 'n tweede groep wat vinnig-sametrekkende tipe 2A-, tipe 2X- en gemengde 2A/2X-vesels bevat, getoon het (Figuur 2A). In beide datastelle was hierdie twee groepe verbind deur 'n klein aantal gemengde tipe 1/2A-vesels. Soos verwag, het oorverteenwoordigingsanalise van die hoof PC-drywers bevestig dat PC2 gedryf is deur kontraktiele en metaboliese handtekeninge (Figuur 2B en Aanvullende Figure 6D–E, Aanvullende Datastelle 5–6). Oor die algemeen is bevind dat MYH-gebaseerde veseltipe voldoende was om deurlopende variasie langs PC2 te verduidelik, met die uitsondering van sogenaamde 2X-vesels wat dwarsdeur die transkriptome binne die vinnige groep versprei was.
A. Hoofkomponentanalise (PCA) grafieke van transkriptome- en proteoomdatastelle gekleur volgens veseltipe gebaseer op MYH. B. Verrykingsanalise van transkrip- en proteïendrywers in PC2 en PC1. Statistiese analise is uitgevoer met behulp van die clusterProfiler-pakket en Benjamini-Hochberg-aangepaste p-waardes. C, D. PCA-grafieke gekleur volgens intersellulêre adhesiegeenontologie (GO) terme in die transkriptome- en kostameer-GO terme in die proteoom. Pyle verteenwoordig transkrip- en proteïendrywers en hul rigtings. E, F. Uniforme veelvuldige benadering en projeksie (UMAP) kenmerkgrafieke van klinies relevante kenmerke wat uitdrukkingsgradiënte toon onafhanklik van stadige/vinnige veseltipe. G, H. Korrelasies tussen PC2- en PC1-drywers in transkriptome en proteome.
Onverwags het MYH-gebaseerde miofibertipe slegs die tweede hoogste graad van veranderlikheid (PC2) verklaar, wat daarop dui dat ander biologiese faktore wat nie verband hou met MYH-gebaseerde miofibertipe (PC1) nie, 'n belangrike rol speel in die regulering van skeletspierveselheterogeniteit. Oorverteenwoordigingsanalise van die topdrywers in PC1 het aan die lig gebring dat veranderlikheid in PC1 hoofsaaklik bepaal is deur sel-sel adhesie en ribosoominhoud in die transkriptome, en kostamere en ribosomale proteïene in die proteoom (Figuur 2B en Aanvullende Figure 6D–E, Aanvullende Datastel 7). In skeletspier verbind kostamere die Z-skyf met die sarkolemma en is betrokke by kragoordrag en sein. 25 Geannoteerde PCA-plotte met behulp van sel-sel adhesie (transkriptome, Figuur 2C) en kostameer (proteoom, Figuur 2D) kenmerke het 'n sterk linksverskuiwing in PC1 aan die lig gebring, wat aandui dat hierdie kenmerke in sekere vesels verryk is.
'n Meer gedetailleerde ondersoek van mioveselgroepering op die UMAP-vlak het aan die lig gebring dat die meeste kenmerke 'n mioveseltipe-onafhanklike MYH-gebaseerde ekspressiegradiënt vertoon het eerder as miovesel-subgroepspesifiek. Hierdie kontinuïteit is waargeneem vir verskeie gene wat met patologiese toestande geassosieer word (Figuur 2E), soos CHCHD10 (neuromuskulêre siekte), SLIT3 (spieratrofie), CTDNEP1 (spiersiekte). Hierdie kontinuïteit is ook oor die proteoom waargeneem, insluitend proteïene wat met neurologiese afwykings geassosieer word (UGDH), insulienseintransduksie (PHIP) en transkripsie (HIST1H2AB) (Figuur 2F). Gesamentlik dui hierdie data op kontinuïteit in veseltipe-onafhanklike stadige/vinnige ruk-heterogeniteit oor verskillende miovesels.
Interessant genoeg het drywergene in PC2 goeie transkriptoom-proteoom-korrelasie (r = 0.663) getoon (Figuur 2G), wat daarop dui dat stadige en vinnige veseltipes, en in besonder die kontraktiele en metaboliese eienskappe van skeletspiervesels, transkripsioneel gereguleer word. Dryfgene in PC1 het egter geen transkriptoom-proteoom-korrelasie getoon nie (r = -0.027) (Figuur 2H), wat daarop dui dat variasies wat nie verband hou met stadige/vinnige veseltipes nie, grootliks post-transkripsioneel gereguleer word. Omdat variasies in PC1 hoofsaaklik deur ribosomale geen-ontologieterme verklaar is, en aangesien ribosome 'n belangrike en gespesialiseerde rol in die sel speel deur aktief deel te neem aan en proteïenvertaling te beïnvloed,31 het ons vervolgens hierdie onverwagte ribosomale heterogeniteit ondersoek.
Ons het eers die proteomika hoofkomponentanaliseplot gekleur volgens die relatiewe oorvloed van proteïene in die GOCC-term "sitoplasmiese ribosoom" (Figuur 3A). Alhoewel hierdie term verryk is aan die positiewe kant van PC1, wat 'n klein gradiënt tot gevolg het, dryf ribosomale proteïene partisionering in beide rigtings van PC1 aan (Figuur 3A). Ribosomale proteïene verryk aan die negatiewe kant van PC1 het RPL18, RPS18 en RPS13 ingesluit (Figuur 3B), terwyl RPL31, RPL35 en RPL38 (Figuur 3C) die hoofdrywers aan die positiewe kant van PC1 was. Interessant genoeg was RPL38 en RPS13 hoogs uitgedruk in skeletspiere in vergelyking met ander weefsels (Aanvullende Figuur 7A). Hierdie kenmerkende ribosomale handtekeninge in PC1 is nie in die transkriptome waargeneem nie (Aanvullende Figuur 7B), wat dui op post-transkripsionele regulering.
A. Hoofkomponentanalise (HKA) plot gekleur volgens sitoplasmiese ribosomale geenontologie (GO) terme oor die proteoom. Pyle dui die rigting van proteïen-gemedieerde variasie in die HKA-plot aan. Lynlengte stem ooreen met die hoofkomponenttelling vir 'n gegewe proteïen. B, C. HKA-kenmerkplotte vir RPS13 en RPL38. D. Ongesuperviseerde hiërargiese groeperingsanalise van sitoplasmiese ribosomale proteïene. E. Strukturele model van die 80S ribosoom (PDB: 4V6X) wat ribosomale proteïene met verskillende oorvloed in skeletspiervesels uitlig. F. Ribosomale proteïene met verskillende stoïgiometrie gelokaliseer naby die mRNA-uitgangskanaal.
Die konsepte van ribosomale heterogeniteit en spesialisasie is voorheen voorgestel, waardeur die teenwoordigheid van verskillende ribosomale subpopulasies (ribosomale heterogeniteit) proteïentranslasie in verskillende weefsels32 en selle33 direk kan beïnvloed deur die selektiewe translasie van spesifieke mRNA-transkripsiepoele34 (ribosomale spesialisasie). Om subpopulasies van ribosomale proteïene wat saam in skeletspiervesels uitgedruk word, te identifiseer, het ons 'n onbewaakte hiërargiese groeperingsanalise van ribosomale proteïene in die proteoom uitgevoer (Figuur 3D, Aanvullende Datastel 8). Soos verwag, het ribosomale proteïene nie volgens veseltipe gegroepeer gebaseer op MYH nie. Ons het egter drie verskillende groepe ribosomale proteïene geïdentifiseer; die eerste groep (ribosomale_groep_1) word saam met RPL38 gekoördineer en het dus verhoogde uitdrukking in vesels met 'n positiewe PC1-profiel. Die tweede groep (ribosomale_groep_2) word saam met RPS13 gekoördineer en is verhoog in vesels met 'n negatiewe PC1-profiel. Die derde groep (ribosomale_groep_3) toon nie gekoördineerde differensiële uitdrukking in skeletspiervesels nie en kan beskou word as die "kern"-skeletspier-ribosomale proteïen. Beide ribosomale groepe 1 en 2 bevat ribosomale proteïene wat voorheen getoon is om alternatiewe translasie te reguleer (bv. RPL10A, RPL38, RPS19 en RPS25) en funksioneel ontwikkeling te beïnvloed (bv. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 In ooreenstemming met die PCA-resultate, het die waargenome heterogene voorstelling van hierdie ribosomale proteïene oor vesels ook kontinuïteit getoon (Aanvullende Figuur 7C).
Om die ligging van heterogene ribosomale proteïene binne die ribosoom te visualiseer, het ons 'n strukturele model van die menslike 80S-ribosoom (Protein Data Bank: 4V6X) gebruik (Figuur 3E). Nadat ribosomale proteïene wat aan verskillende ribosomale groepe behoort, geïsoleer is, was hul liggings nie noukeurig in lyn nie, wat daarop dui dat ons benadering nie daarin geslaag het om verryking vir sekere streke/fraksies van die ribosoom te bied nie. Interessant genoeg was die proporsie groot subeenheidproteïene in groep 2 egter laer as in groepe 1 en 3 (Aanvullende Figuur 7D). Ons het waargeneem dat proteïene met veranderde stoïgiometrie in skeletspiervesels hoofsaaklik op die ribosoomoppervlak gelokaliseer was (Figuur 3E), wat ooreenstem met hul vermoë om met interne ribosoom-intreeplek (IRES)-elemente in verskillende mRNA-populasies te kommunikeer, en sodoende selektiewe translasie te koördineer. 40, 41 Verder was baie proteïene met veranderde stoïgiometrie in skeletspiervesels naby funksionele streke soos die mRNA-uitgangstunnel geleë (Figuur 3F), wat selektief translasionele verlenging en arrestasie van spesifieke peptiede reguleer. 42 Opsommend dui ons data daarop dat die stoïgiometrie van skeletspier-ribosomale proteïene heterogeniteit toon, wat lei tot verskille tussen skeletspiervesels.
Ons het vervolgens begin om vinnige en stadige veselhandtekeninge te identifiseer en die meganismes van hul transkripsieregulering te ondersoek. Deur die vinnige en stadige veselgroepe wat deur UMAP in die twee datastelle gedefinieer word (Figure 1G–H en 4A–B) te vergelyk, het transkriptomiese en proteomiese ontledings onderskeidelik 1366 en 804 differensieel oorvloedige kenmerke geïdentifiseer (Figure 4A–B, Aanvullende Datastelle 9–12). Ons het die verwagte verskille in handtekeninge waargeneem wat verband hou met sarkomere (bv. tropomiosien en troponien), eksitasie-kontraksiekoppeling (SERCA-isovorme) en energiemetabolisme (bv. ALDOA en CKB). Verder is transkripsies en proteïene wat proteïenubikwitinasie reguleer, differensieel uitgedruk in vinnige en stadige vesels (bv. USP54, SH3RF2, USP28 en USP48) (Figure 4A–B). Boonop is die mikrobiese proteïengeen RP11-451G4.2 (DWORF), wat voorheen getoon is om differensieel uitgedruk te word oor lamspierveseltipes43 en SERCA-aktiwiteit in hartspier44 verbeter, beduidend opgereguleer in stadige skeletspiervesels (Figuur 4A). Net so is beduidende verskille op individuele veselvlak waargeneem in bekende kenmerke soos metabolisme-verwante laktaatdehidrogenase-isovorme (LDHA en LDHB, Figuur 4C en Aanvullende Figuur 8A)45,46 sowel as voorheen onbekende veseltipe-spesifieke kenmerke (soos IRX3, USP54, USP28 en DPYSL3) (Figuur 4C). Daar was 'n beduidende oorvleueling van differensieel uitgedrukte kenmerke tussen die transkriptomiese en proteomiese datastelle (Aanvullende Figuur 8B), sowel as 'n vouveranderingskorrelasie wat hoofsaaklik gedryf word deur die meer uitgesproke differensiële uitdrukking van sarkomeerkenmerke (Aanvullende Figuur 8C). Dit is opmerklik dat sommige handtekeninge (bv. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) sterk post-transkripsionele regulering slegs op die proteomiese vlak getoon het en stadige/vinnige trekkveseltipe-spesifieke ekspressieprofiele gehad het (Aanvullende Figuur 8C).
A en B vulkaangrafieke wat stadige en vinnige trosse vergelyk, geïdentifiseer deur die uniforme veelvuldige benadering en projeksie (UMAP) grafieke in Figure 1G–H. Gekleurde kolletjies verteenwoordig transkripsies of proteïene wat beduidend verskil by FDR < 0.05, en donkerder kolletjies verteenwoordig transkripsies of proteïene wat beduidend verskil by logaritmiese verandering > 1. Tweerigting-statistiese analise is uitgevoer met behulp van die DESeq2 Wald-toets met Benjamini-Hochberg-aangepaste p-waardes (transkriptomika) of die Limma lineêre modelmetode met empiriese Bayesiaanse analise gevolg deur Benjamini-Hochberg-aanpassing vir veelvuldige vergelykings (proteomika). C Handtekeninggrafieke van geselekteerde differensieel uitgedrukte gene of proteïene tussen stadige en vinnige vesels. D Verrykingsanalise van beduidend differensieel uitgedrukte transkripsies en proteïene. Oorvleuelende waardes word in beide datastelle verryk, transkriptoomwaardes word slegs in die transkriptoom verryk, en proteoomwaardes word slegs in die proteoom verryk. Statistiese analise is uitgevoer met behulp van die clusterProfiler-pakket met Benjamini-Hochberg-aangepaste p-waardes. E. Veseltipe-spesifieke transkripsiefaktore geïdentifiseer deur SCENIC gebaseer op SCENIC-afgeleide reguleerderspesifisiteittellings en differensiële mRNA-uitdrukking tussen veseltipes. F. Profilering van geselekteerde transkripsiefaktore wat differensieel uitgedruk word tussen stadige en vinnige vesels.
Ons het toe 'n oorverteenwoordigingsanalise van differensieel verteenwoordigde gene en proteïene uitgevoer (Figuur 4D, Aanvullende Datastel 13). Padverryking vir kenmerke wat tussen die twee datastelle verskil het, het verwagte verskille aan die lig gebring, soos vetsuur β-oksidasie en ketoonmetabolismeprosesse (stadige vesels), miofilament/spierkontraksie (onderskeidelik vinnige en stadige vesels), en koolhidraatkataboliese prosesse (vinnige vesels). Serien/treonienproteïenfosfatase-aktiwiteit was ook verhoog in vinnige vesels, gedryf deur kenmerke soos die regulatoriese en katalitiese fosfatase-subeenhede (PPP3CB, PPP1R3D en PPP1R3A), wat bekend is om glikogeenmetabolisme te reguleer (47) (Aanvullende Figure 8D–E). Ander bane wat verryk is met vinnige vesels het verwerkingsliggame (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) in die proteoom ingesluit (Aanvullende Fig. 8F), wat moontlik betrokke is by post-transkripsionele regulering (48), en transkripsiefaktoraktiwiteit (SREBF1, RXRG, RORA) in die transkriptoom (Aanvullende Fig. 8G). Stadige vesels is verryk met oksidoreduktase-aktiwiteit (BDH1, DCXR, TXN2) (Aanvullende Fig. 8H), amiedbinding (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Aanvullende Fig. 8I), ekstrasellulêre matriks (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Aanvullende Fig. 8J), en reseptor-ligandaktiwiteit (FNDC5, SPX, NENF) (Aanvullende Fig. 8K).
Om verdere insig te verkry in die transkripsieregulering onderliggend aan stadige/vinnige spierveseltipe-eienskappe, het ons transkripsiefaktorverrykingsanalise uitgevoer met behulp van SCENIC49 (Aanvullende Datastel 14). Baie transkripsiefaktore was beduidend verryk tussen vinnige en stadige spiervesels (Figuur 4E). Dit het transkripsiefaktore soos MAFA ingesluit, wat voorheen gekoppel is aan vinnige spierveselontwikkeling,50 sowel as verskeie transkripsiefaktore wat nie voorheen met spierveseltipe-spesifieke geenprogramme geassosieer is nie. Onder hierdie was PITX1, EGR1 en MYF6 die mees verrykte transkripsiefaktore in vinnige spiervesels (Figuur 4E). In teenstelling hiermee was ZSCAN30 en EPAS1 (ook bekend as HIF2A) die mees verrykte transkripsiefaktore in stadige spiervesels (Figuur 4E). In ooreenstemming hiermee is MAFA op hoër vlakke in die UMAP-streek uitgedruk wat ooreenstem met vinnige spiervesels, terwyl EPAS1 die teenoorgestelde uitdrukkingspatroon gehad het (Figuur 4F).
Benewens bekende proteïenkoderende gene, is daar talle nie-koderende RNA-biotipes wat moontlik betrokke is by die regulering van menslike ontwikkeling en siektes. 51, 52 In transkriptoomdatastelle toon verskeie nie-koderende RNA's veseltipespesifisiteit (Figuur 5A en Aanvullende Datastel 15), insluitend LINC01405, wat hoogs spesifiek is vir stadige vesels en na bewering verminder is in spiere van pasiënte met mitochondriale miopatie. 53 In teenstelling hiermee toon RP11-255P5.3, wat ooreenstem met die lnc-ERCC5-5-geen (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, vinnige veseltipespesifisiteit. Beide LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) en RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) vertoon skeletspierspesifisiteit (Aanvullende Figure 9A–B) en het geen bekende kontraktiele gene binne hul 1 Mb genomiese omgewing nie, wat daarop dui dat hulle 'n gespesialiseerde rol speel in die regulering van veseltipes eerder as die regulering van aangrensende kontraktiele gene. Die stadige/vinnige veseltipe-spesifieke ekspressieprofiele van onderskeidelik LINC01405 en RP11-255P5.3 is bevestig met behulp van RNAscope (Figure 5B–C).
A. Nie-koderende RNA-transkripte word beduidend gereguleer in stadige en vinnig-saamtrekkende spiervesels. B. Verteenwoordigende RNAskoopbeelde wat die stadige en vinnig-saamtrekkende veseltipespesifisiteit van LINC01405 en RP11-255P5.3 toon, onderskeidelik. Skaalbalk = 50 μm. C. Kwantifisering van mioveseltipe-spesifieke nie-koderende RNA-ekspressie soos bepaal deur RNAskoop (n = 3 biopsieë van onafhanklike individue, wat vinnige en stadige spiervesels binne elke individu vergelyk). Statistiese analise is uitgevoer met behulp van 'n tweesydige Student se t-toets. Boksplotte toon die mediaan en die eerste en derde kwartiele, met snorre wat na die minimum en maksimum waardes wys. D. De novo mikrobiese proteïenidentifikasiewerkvloei (geskep met BioRender.com). E. Die mikrobiese proteïen LINC01405_ORF408:17441:17358 word spesifiek uitgedruk in stadige skeletspiervesels (n=5 biopsieë van onafhanklike deelnemers, wat vinnige en stadige spiervesels in elke deelnemer vergelyk). Statistiese analise is uitgevoer met behulp van die Limm lineêre modelmetode gekombineer met 'n empiriese Bayesiaanse benadering, gevolg deur die Benjamini-Hochberg-metode vir veelvuldige vergelykings met p-waarde-aanpassing. Boksplotte toon die mediaan, eerste en derde kwartiele, met baarde wat na die maksimum/minimum waardes wys.
Onlangs het studies getoon dat baie vermeende nie-koderende transkripte vir getranskribeerde mikrobiese proteïene kodeer, waarvan sommige spierfunksie reguleer. 44, 55 Om mikrobiese proteïene met potensiële veseltipespesifisiteit te identifiseer, het ons ons 1000-veselproteoomdatastel deursoek met behulp van 'n persoonlike FASTA-lêer wat die volgordes van nie-koderende transkripte (n = 305) bevat wat in die 1000-veseltranskriptoomdatastel gevind is (Figuur 5D). Ons het 197 mikrobiese proteïene uit 22 verskillende transkripte geïdentifiseer, waarvan 71 differensieel gereguleer is tussen stadige en vinnige skeletspiervesels (Aanvullende Figuur 9C en Aanvullende Datastel 16). Vir LINC01405 is drie mikrobiese proteïenprodukte geïdentifiseer, waarvan een soortgelyke stadige vespesifisiteit as sy transkripsie getoon het (Figuur 5E en Aanvullende Figuur 9D). Dus het ons LINC01405 geïdentifiseer as 'n geen wat kodeer vir 'n mikrobiese proteïen spesifiek vir stadige skeletspiervesels.
Ons het 'n omvattende werkvloei ontwikkel vir grootskaalse proteomiese karakterisering van individuele spiervesels en het reguleerders van veselheterogeniteit in gesonde toestande geïdentifiseer. Ons het hierdie werkvloei toegepas om te verstaan hoe nemaliene miopatieë die heterogeniteit van skeletspiervesels beïnvloed. Nemaliene miopatieë is oorgeërfde spiersiektes wat spierswakheid veroorsaak en, by geaffekteerde kinders, 'n reeks komplikasies toon, insluitend respiratoriese nood, skoliose en beperkte ledemaatmobiliteit. 19,20 Tipies, in nemaliene miopatieë, lei patogene variante in gene soos aktien alfa 1 (ACTA1) tot 'n oorheersing van stadig-trek vesel-mioveselsamestelling, hoewel hierdie effek heterogeen is. Een noemenswaardige uitsondering is troponien T1 nemaliene miopatie (TNNT1), wat 'n oorheersing van vinnige vesels het. Dus, 'n beter begrip van die heterogeniteit onderliggend aan die skeletspiervesel-disregulering wat in nemaliene miopatieë waargeneem word, kan help om die komplekse verband tussen hierdie siektes en mioveseltipe te ontrafel.
In vergelyking met gesonde kontroles (n=3 per groep), het miovesels wat van nemalienmiopatie-pasiënte met mutasies in die ACTA1- en TNNT1-gene geïsoleer is, merkbare mioveselatrofie of -distrofie getoon (Figuur 6A, Aanvullende Tabel 3). Dit het beduidende tegniese uitdagings vir proteomiese analise gebied as gevolg van die beperkte hoeveelheid beskikbare materiaal. Ten spyte hiervan kon ons 2485 proteïene in 272 skeletmiovesels opspoor. Na filtrering vir ten minste 1000 gekwantifiseerde proteïene per vesel, is 250 vesels aan daaropvolgende bioinformatika-analise onderwerp. Na filtrering is 'n gemiddeld van 1573 ± 359 proteïene per vesel gekwantifiseer (Aanvullende Figuur 10A, Aanvullende Datastelle 17–18). Dit is opmerklik dat die proteoomdiepte van nemalienmiopatie-pasiëntmonsters, ten spyte van die beduidende vermindering in veselgrootte, slegs beskeie verminder is. Boonop het die verwerking van hierdie data met behulp van ons eie FASTA-lêers (insluitend nie-koderende transkripsies) ons toegelaat om vyf mikrobiese proteïene in skeletmiovesels van nemalienmipatie-pasiënte te identifiseer (Aanvullende Datastel 19). Die dinamiese omvang van die proteoom was aansienlik breër, en totale proteïene in die kontrolegroep het goed gekorreleer met die resultate van 'n vorige 1000-vesel proteoom-analise (Aanvullende Fig. 10B-C).
A. Mikroskopiese beelde wat veselatrofie of -distrofie en die oorheersing van verskillende veseltipes toon gebaseer op MYH in ACTA1- en TNNT1 nemaliene miopatieë (NM). Skaalbalk = 100 μm. Om die reproduceerbaarheid van kleuring in ACTA1- en TNNT1-pasiënte te verseker, is drie pasiëntbiopsieë twee tot drie keer gekleur (vier snitte per geval) voordat verteenwoordigende beelde gekies is. B. Veseltipe-verhoudings in deelnemers gebaseer op MYH. C. Hoofkomponentanalise (PCA) plot van skeletspiervesels in pasiënte met nemaliene miopatieë en kontroles. D. Skeletspiervesels van pasiënte met nemaliene miopatieë en kontroles geprojekteer op 'n PCA-plot bepaal uit die 1000 vesels wat in Figuur 2 geanaliseer is. Byvoorbeeld, vulkaanplotte wat verskille vergelyk tussen deelnemers met ACTA1- en TNNT1 nemaliene miopatieë en kontroles, en tussen deelnemers met ACTA1- en TNNT1 nemaliene miopatieë. Gekleurde sirkels dui proteïene aan wat beduidend verskil het by π < 0.05, en donker kolletjies dui proteïene aan wat beduidend verskil het by FDR < 0.05. Statistiese analise is uitgevoer met behulp van die Limma lineêre modelmetode en empiriese Bayesiaanse metodes, gevolg deur p-waarde-aanpassing vir veelvuldige vergelykings met behulp van die Benjamini-Hochberg-metode. H. Verrykingsanalise van beduidend differensieel uitgedrukte proteïene oor die hele proteoom en in tipe 1- en 2A-vesels. Statistiese analise is uitgevoer met behulp van die clusterProfiler-pakket en Benjamini-Hochberg-aangepaste p-waardes. I, J. Hoofkomponentanalise (PCA) grafieke gekleur deur ekstrasellulêre matriks en mitochondriale geen-ontologie (GO) terme.
Omdat nemaliene miopatieë die proporsie van MYH-uitdrukkende miofibertipes in skeletspiere kan beïnvloed,19,20 het ons eers die MYH-uitdrukkende miofibertipes in pasiënte met nemaliene miopatieë en kontroles ondersoek. Ons het die miofibertipe bepaal deur 'n onbevooroordeelde metode te gebruik wat voorheen vir die 1000 miofiber-toets beskryf is (Aanvullende Fig. 10D-E) en het weer misluk om suiwer 2X miofibers te identifiseer (Figuur 6B). Ons het 'n heterogene effek van nemaliene miopatieë op miofibertipe waargeneem, aangesien twee pasiënte met ACTA1-mutasies 'n verhoogde proporsie tipe 1 miofibers gehad het, terwyl twee pasiënte met TNNT1 nemaliene miopatie 'n verlaagde proporsie tipe 1 miofibers gehad het (Figuur 6B). Inderdaad, die uitdrukking van MYH2 en vinnige troponien-isovorme (TNNC2, TNNI2, en TNNT3) was verminder in ACTA1-nemalien-miopatieë, terwyl MYH7-uitdrukking verminder was in TNNT1-nemalien-miopatieë (Aanvullende Figuur 11A). Dit stem ooreen met vorige verslae van heterogene mioveseltipe-wisseling in nemalien-miopatieë.19,20 Ons het hierdie resultate deur immunohistochemie bevestig en gevind dat pasiënte met ACTA1-nemalien-miopatie 'n oorheersing van tipe 1-miovesels gehad het, terwyl pasiënte met TNNT1-nemalien-miopatie die teenoorgestelde patroon gehad het (Figuur 6A).
Op die enkelvesel-proteoomvlak het skeletspiervesels van ACTA1- en TNNT1 nemalienmiopatie-pasiënte saamgegroepeer met die meerderheid van die kontrolevesels, met TNNT1 nemalienmiopatie-vesels wat oor die algemeen die ergste geaffekteer is (Figuur 6C). Dit was veral duidelik toe hoofkomponentanalise (PCA) grafieke van pseudo-opgeblaasde vesels vir elke pasiënt geplot is, met TNNT1 nemalienmiopatie-pasiënte 2 en 3 wat die verste van die kontrolemonsters afkomstig is (Aanvullende Figuur 11B, Aanvullende Datastel 20). Om beter te verstaan hoe vesels van miopatie-pasiënte vergelyk met gesonde vesels, het ons gedetailleerde inligting gebruik wat verkry is uit proteomiese analise van 1 000 vesels van gesonde volwasse deelnemers. Ons het vesels uit die miopatie-datastel (ACTA1- en TNNT1 nemalienmiopatie-pasiënte en kontroles) geprojekteer op die PCA-grafiek wat verkry is uit die 1000-vesel proteomiese analise (Figuur 6D). Die verspreiding van MYH-veseltipes langs PC2 in kontrolevelle was soortgelyk aan die veselverspreiding wat verkry is uit die 1000-vesel proteomiese analise. Die meeste vesels in nemaliene miopatie-pasiënte het egter afwaarts teen PC2 verskuif, wat oorvleuel met gesonde vinnige-saamtrekvesels, ongeag hul oorspronklike MYH-veseltipe. Dus, alhoewel pasiënte met ACTA1 nemaliene miopatie 'n verskuiwing na tipe 1-vesels getoon het toe dit gekwantifiseer is met behulp van MYH-gebaseerde metodes, het beide ACTA1 nemaliene miopatie en TNNT1 nemaliene miopatie die skeletspierveselproteoom na vinnige-saamtrekvesels verskuif.
Ons het toe elke pasiëntgroep direk met gesonde kontroles vergelyk en onderskeidelik 256 en 552 differensieel uitgedrukte proteïene in ACTA1- en TNNT1-nemalienmiopatieë geïdentifiseer (Figuur 6E–G en Aanvullende Figuur 11C, Aanvullende Datastel 21). Geenverrykingsanalise het 'n gekoördineerde afname in mitochondriale proteïene aan die lig gebring (Figuur 6H–I, Aanvullende Datastel 22). Verbasend genoeg, ten spyte van die differensiële oorheersing van veseltipes in ACTA1- en TNNT1-nemalienmiopatieë, was hierdie afname heeltemal onafhanklik van die MYH-gebaseerde veseltipe (Figuur 6H en Aanvullende Figure 11D–I, Aanvullende Datastel 23). Drie mikrobiese proteïene is ook in ACTA1- of TNNT1-nemalienmiopatieë gereguleer. Twee van hierdie mikroproteïene, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (ook bekend as LINC00598 of Lnc-FOXO1) en ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), het slegs differensiële oorvloed in tipe 1-miovesels getoon. Daar is voorheen berig dat ENSG00000215483_TR14_ORF67 'n rol in selsiklusregulering speel. 56 Aan die ander kant was ENSG00000232046_TR1_ORF437 (wat ooreenstem met LINC01798) verhoog in beide tipe 1- en tipe 2A-miovesels in ACTA1-nemalienmopatie in vergelyking met gesonde kontroles (Aanvullende Figuur 12A, Aanvullende Datastel 24). In teenstelling hiermee, was ribosomale proteïene grootliks onaangeraak deur nemaliene miopatie, alhoewel RPS17 afgereguleer was in ACTA1 nemaliene miopatie (Fig. 6E).
Verrykingsanalise het ook opregulering van immuunstelselprosesse in ACTA1- en TNNT1-nemalienmopatieë aan die lig gebring, terwyl seladhesie ook verhoog is in TNNT1-nemalienmopatie (Figuur 6H). Die verryking van hierdie ekstrasellulêre faktore is weerspieël deur die ekstrasellulêre matriksproteïene wat PCA in PC1 en PC2 in 'n negatiewe rigting verskuif (d.w.s. na die mees geaffekteerde vesels) (Figuur 6J). Beide pasiëntgroepe het verhoogde uitdrukking van ekstrasellulêre proteïene getoon wat betrokke is by immuunresponse en sarkolemmale herstelmeganismes, soos anneksiene (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 en hul interaktiewe proteïen S100A1159 (Aanvullende Figure 12B-C). Daar is voorheen berig dat hierdie proses versterk is in spierdistrofieë60, maar, sover ons weet, is dit nie voorheen geassosieer met nemaliene miopatieë nie. Normale funksie van hierdie molekulêre masjinerie is nodig vir sarkolemmale herstel na besering en vir die samesmelting van nuutgevormde miosiete met miovesels58,61. Dus dui die verhoogde aktiwiteit van hierdie proses in beide pasiëntgroepe op 'n herstelende reaksie op besering wat deur miovesel-onstabiliteit veroorsaak word.
Die effekte van elke nemalienmipatie was goed gekorreleer (r = 0.736) en het redelike oorvleueling getoon (Aanvullende Figure 11A–B), wat aandui dat ACTA1 en TNNT1 nemalienmipatie soortgelyke effekte op die proteoom het. Sommige proteïene is egter slegs in ACTA1- of TNNT1 nemalienmipatie gereguleer (Aanvullende Figure 11A en C). Die profibrotiese proteïen MFAP4 was een van die mees opgereguleerde proteïene in TNNT1 nemalienmipatie, maar het onveranderd gebly in ACTA1 nemalienmipatie. SKIC8, 'n komponent van die PAF1C-kompleks wat verantwoordelik is vir die regulering van HOX-geentranskripsie, is afgereguleer in TNNT1 nemalienmipatie, maar nie beïnvloed in ACTA1 nemalienmipatie nie (Aanvullende Figuur 11A). Direkte vergelyking van ACTA1 en TNNT1 nemalien miopatie het groter verlagings in mitochondriale proteïene en toenames in immuunstelselproteïene in TNNT1 nemalien miopatie aan die lig gebring (Figuur 6G–H en Aanvullende Figure 11C en 11H–I). Hierdie data stem ooreen met die groter atrofie/distrofie wat waargeneem is in TNNT1 nemalien miopatie in vergelyking met TNNT1 nemalien miopatie (Figuur 6A), wat daarop dui dat TNNT1 nemalien miopatie 'n meer ernstige vorm van die siekte verteenwoordig.
Om te bepaal of die waargenome effekte van nemalienmiopatie op die hele spiervlak voortduur, het ons 'n grootskaalse proteomiese analise van spierbiopsieë van dieselfde kohort van TNNT1 nemalienmiopatie-pasiënte uitgevoer en hulle vergelyk met kontroles (n=3 per groep) (Aanvullende Fig. 13A, Aanvullende Datastel 25). Soos verwag, was die kontroles nou verwant in hoofkomponentanalise, terwyl TNNT1 nemalienmiopatie-pasiënte hoër intersteekproefvariasie getoon het, soortgelyk aan dié wat in enkelveselanalise gesien word (Aanvullende Fig. 13B). Grootskaalse analise het die differensieel uitgedrukte proteïene (Aanvullende Fig. 13C, Aanvullende Datastel 26) en biologiese prosesse (Aanvullende Fig. 13D, Aanvullende Datastel 27) gereproduseer, wat uitgelig is deur individuele vesels te vergelyk, maar die vermoë verloor om tussen verskillende veseltipes te onderskei en het nie rekening gehou met heterogene siekte-effekte oor vesels nie.
Saamgevat toon hierdie data dat enkel-miovesel proteomika kliniese biologiese kenmerke kan verduidelik wat nie deur geteikende metodes soos immunoblotting opspoorbaar is nie. Verder beklemtoon hierdie data die beperkings van die gebruik van aktienveseltipering (MYH) alleen om fenotipiese aanpassing te beskryf. Inderdaad, hoewel veseltipe-wisseling verskil tussen aktien- en troponien nemalienmiopatieë, ontkoppel beide nemalienmiopatieë MYH-veseltipering van skeletspierveselmetabolisme na 'n vinniger en minder oksidatiewe spierproteoom.
Sellulêre heterogeniteit is krities vir weefsels om aan hul uiteenlopende eise te voldoen. In skeletspiere word dit dikwels beskryf as veseltipes wat gekenmerk word deur verskillende grade van kragproduksie en vermoeidheid. Dit is egter duidelik dat dit slegs 'n klein deel van die skeletspiervesel-variabiliteit verklaar, wat baie meer veranderlik, kompleks en veelsydig is as wat voorheen gedink is. Tegnologiese vooruitgang het nou lig gewerp op die faktore wat skeletspiervesels reguleer. Inderdaad, ons data dui daarop dat tipe 2X-vesels moontlik nie 'n duidelike skeletspierveselsubtipe is nie. Verder het ons metaboliese proteïene, ribosomale proteïene en sel-geassosieerde proteïene geïdentifiseer as belangrike bepalers van skeletspiervesel-heterogeniteit. Deur ons proteomiese werkvloei toe te pas op pasiëntmonsters met nematode-miopatie, het ons verder gedemonstreer dat MYH-gebaseerde veseltipering nie skeletspier-heterogeniteit ten volle weerspieël nie, veral wanneer die stelsel versteur word. Inderdaad, ongeag die MYH-gebaseerde veseltipe, lei nematode-miopatie tot 'n verskuiwing na vinniger en minder oksidatiewe vesels.
Skeletspiervesels word sedert die 19de eeu geklassifiseer. Onlangse omika-ontledings het ons toegelaat om die uitdrukkingsprofiele van verskillende MYH-veseltipes en hul reaksies op verskillende stimuli te begin verstaan. Soos hier beskryf, het omika-benaderings ook die voordeel van groter sensitiwiteit vir die kwantifisering van veseltipemerkers as tradisionele teenliggaam-gebaseerde metodes, sonder om staat te maak op die kwantifisering van 'n enkele (of 'n paar) merkers om 'n skeletspierveseltipe te definieer. Ons het komplementêre transkriptomiese en proteomiese werkvloeie gebruik en die resultate geïntegreer om die transkripsionele en post-transkripsionele regulering van veselheterogeniteit in menslike skeletspiervesels te ondersoek. Hierdie werkvloei het gelei tot die mislukking om suiwer 2X-tipe vesels op proteïenvlak in die vastus lateralis van ons kohort van gesonde jong mans te identifiseer. Dit stem ooreen met vorige enkelveselstudies wat <1% suiwer 2X-vesels in gesonde vastus lateralis gevind het, hoewel dit in die toekoms in ander spiere bevestig moet word. Die verskil tussen die opsporing van byna suiwer 2X-vesels op mRNA-vlak en slegs gemengde 2A/2X-vesels op proteïenvlak is raaiselagtig. MYH-isovorm mRNA-ekspressie is nie sirkadiaans nie,67 wat daarop dui dat ons waarskynlik nie die MYH2-aanvangsein in oënskynlik suiwer 2X-vesels op die RNA-vlak "gemis" het nie. Een moontlike verduideliking, hoewel suiwer hipoteties, kan verskille in proteïen- en/of mRNA-stabiliteit tussen MYH-isovorme wees. Inderdaad, geen vinnige vesel is 100% suiwer vir enige MYH-isovorm nie, en dit is onduidelik of MYH1 mRNA-ekspressievlakke in die 70-90%-reeks gelyke MYH1- en MYH2-oorvloed op proteïenvlak tot gevolg sal hê. Wanneer die hele transkriptoom of proteoom egter in ag geneem word, kan trosanalise met vertroue slegs twee afsonderlike trosse identifiseer wat stadige en vinnige skeletspiervesels verteenwoordig, ongeag hul presiese MYH-samestelling. Dit stem ooreen met ontledings wat enkelkern-transkriptomiese benaderings gebruik, wat tipies slegs twee afsonderlike mionukleêre trosse identifiseer. 68, 69, 70 Verder, hoewel vorige proteomiese studies tipe 2X-vesels geïdentifiseer het, groepeer hierdie vesels nie afsonderlik van die res van die vinnige vesels nie en toon slegs 'n klein aantal differensieel oorvloedige proteïene in vergelyking met ander veseltipes gebaseer op MYH. 14 Hierdie resultate dui daarop dat ons moet terugkeer na die vroeë 20ste-eeuse siening van spierveselklassifikasie, wat menslike skeletspiervesels nie in drie afsonderlike klasse verdeel het gebaseer op MYH nie, maar in twee groepe gebaseer op hul metaboliese en kontraktiele eienskappe. 63
Nog belangriker, miovesel-heterogeniteit moet langs verskeie dimensies oorweeg word. Vorige "omika"-studies het in hierdie rigting gewys, wat daarop dui dat skeletspiervesels nie afsonderlike trosse vorm nie, maar langs 'n kontinuum gerangskik is. 11, 13, 14, 64, 71 Hier wys ons dat, benewens verskille in kontraktiele en metaboliese eienskappe van skeletspier, miovesels onderskei kan word deur kenmerke wat verband hou met sel-sel-interaksies en translasiemeganismes. Ons het inderdaad ribosoom-heterogeniteit in skeletspiervesels gevind wat bydra tot heterogeniteit onafhanklik van stadige en vinnige veseltipes. Die onderliggende oorsaak van hierdie aansienlike miovesel-heterogeniteit, onafhanklik van stadige en vinnige veseltipe, bly onduidelik, maar dit kan dui op gespesialiseerde ruimtelike organisasie binne spierfassikels wat optimaal reageer op spesifieke kragte en laste, 72 gespesialiseerde sellulêre of orgaanspesifieke kommunikasie met ander seltipes in die spiermikro-omgewing 73,74,75 of verskille in ribosoomaktiwiteit binne individuele miovesels. Inderdaad, ribosomale heteroplasmie, hetsy deur paraloge substitusie van RPL3 en RPL3L of op die vlak van 2'O-metilering van rRNA, is getoon om geassosieer te wees met skeletspierhipertrofie76,77. Multi-omiese en ruimtelike toepassings gekombineer met funksionele karakterisering van individuele miovesels sal ons begrip van spierbiologie op die multi-omiese vlak78 verder bevorder.
Deur die proteome van enkelmiovesels van pasiënte met nemaliene miopatieë te analiseer, het ons ook die nut, effektiwiteit en toepaslikheid van enkelmiovesel proteomika gedemonstreer om die kliniese patofisiologie van skeletspiere te verduidelik. Verder, deur ons werkvloei te vergelyk met globale proteomiese analise, kon ons demonstreer dat enkelmiovesel proteomika dieselfde diepte van inligting lewer as globale weefselproteomika en hierdie diepte uitbrei deur rekening te hou met intervesel heterogeniteit en mioveseltipe. Benewens die verwagte (alhoewel veranderlike) verskille in veseltipeverhouding wat waargeneem is in ACTA1 en TNNT1 nemaliene miopatieë in vergelyking met gesonde kontroles,19 het ons ook oksidatiewe en ekstrasellulêre hermodellering waargeneem onafhanklik van MYH-gemedieerde veseltipe-skakeling. Fibrose is voorheen gerapporteer in TNNT1 nemaliene miopatieë.19 Ons analise bou egter voort op hierdie bevinding deur ook verhoogde vlakke van ekstrasellulêre afgeskeide stresverwante proteïene, soos anneksiene, betrokke by sarkolemmale herstelmeganismes, in miovesels van pasiënte met ACTA1- en TNNT1 nemaliene miopatieë te openbaar.57,58,59 Ten slotte kan verhoogde anneksienvlakke in miovesels van pasiënte met nemaliene miopatie 'n sellulêre reaksie op die herstel van ernstig atrofiese miovesels verteenwoordig.
Alhoewel hierdie studie die grootste enkelvesel-gehele-spier-omika-analise van mense tot nog toe verteenwoordig, is dit nie sonder beperkings nie. Ons het skeletspiervesels geïsoleer uit 'n relatief klein en homogene steekproef van deelnemers en 'n enkele spier (die vastus lateralis). Daarom is dit onmoontlik om die bestaan van spesifieke veselpopulasies oor spiertipes en by uiterstes van spierfisiologie uit te sluit. Ons kan byvoorbeeld nie die moontlikheid uitsluit dat 'n subgroep van ultrasnelle vesels (bv. suiwer 2X-vesels) in hoogs opgeleide naellopers en/of kragatlete79 of gedurende periodes van spieronaktiwiteit66,80 ontstaan nie. Verder het die beperkte steekproefgrootte van deelnemers ons verhinder om geslagsverskille in veselheterogeniteit te ondersoek, aangesien dit bekend is dat veseltipeverhoudings tussen mans en vroue verskil. Verder kon ons nie transkriptomiese en proteomiese analises op dieselfde spiervesels of monsters van dieselfde deelnemers uitvoer nie. Soos ons en ander voortgaan om enkelsel- en enkelmiovesel-ontledings te optimaliseer deur omika-analise te gebruik om ultra-lae monsterinsette te behaal (soos hier gedemonstreer in die analise van vesels van pasiënte met mitochondriale miopatie), word die geleentheid om multi-omika (en funksionele) benaderings binne enkelspiervesels te kombineer duidelik.
Oor die algemeen identifiseer en verduidelik ons data transkripsie- en post-transkripsie-dryfvere van skeletspierheterogeniteit. Spesifiek bied ons data aan wat 'n langdurige dogma in skeletspierfisiologie wat verband hou met die klassieke MYH-gebaseerde definisie van veseltipes, uitdaag. Ons hoop om die debat te hernu en uiteindelik ons begrip van skeletspierveselklassifikasie en -heterogeniteit te heroorweeg.
Veertien Kaukasiese deelnemers (12 mans en 2 vroue) het vrywillig ingestem om aan hierdie studie deel te neem. Die studie is goedgekeur deur die Etiekkomitee van die Universiteitshospitaal van Gent (BC-10237), het voldoen aan die Helsinki-verklaring van 2013 en is geregistreer by ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Algemene eienskappe van die deelnemers word in Aanvullende Tabel 1 aangebied. Nadat mondelinge en skriftelike ingeligte toestemming verkry is, het deelnemers 'n mediese ondersoek ondergaan voor finale insluiting in die studie. Deelnemers was jonk (22-42 jaar), gesond (geen mediese toestande, geen rookgeskiedenis nie) en matig fisies aktief. Maksimum suurstofopname is bepaal met behulp van 'n trap-ergometer vir die assessering van fisieke fiksheid soos voorheen beskryf. 81
Spierbiopsiemonsters is drie keer, 14 dae uitmekaar, in rus en in die vastende toestand versamel. Omdat hierdie monsters as deel van 'n groter studie versamel is, het deelnemers 40 minute voor die biopsie 'n plasebo (laktose), 'n H1-reseptor-antagonis (540 mg fexofenadine) of 'n H2-reseptor-antagonis (40 mg famotidien) ingeneem. Ons het voorheen gedemonstreer dat hierdie histamienreseptor-antagoniste nie rustende skeletspierfiksheid81 beïnvloed nie, en geen toestandsverwante groepering is in ons kwaliteitskontrole-grafieke waargeneem nie (Aanvullende Figure 3 en 6). 'n Gestandaardiseerde dieet (41.4 kcal/kg liggaamsgewig, 5.1 g/kg liggaamsgewig koolhidrate, 1.4 g/kg liggaamsgewig proteïen en 1.6 g/kg liggaamsgewig vet) is vir 48 uur voor elke eksperimentele dag gehandhaaf, en 'n gestandaardiseerde ontbyt (1.5 g/kg liggaamsgewig koolhidrate) is in die oggend van die eksperimentele dag verbruik. Onder plaaslike verdowing (0.5 ml 1% lidokaïen sonder epinefrien) is spierbiopsieë van die vastus lateralis-spier verkry deur middel van perkutane Bergström-aspirasie.82 Spiermonsters is onmiddellik in RNAlater ingebed en by 4°C gestoor tot manuele veseldisseksie (tot 3 dae).
Vars geïsoleerde mioveselbondels is oorgedra na vars RNAlater-medium in 'n kweekbakkie. Individuele miovesels is toe handmatig gedissekteer met behulp van 'n stereomikroskoop en fyn pinset. Vyf-en-twintig vesels is uit elke biopsie gedissekteer, met spesiale aandag aan die seleksie van vesels uit verskillende areas van die biopsie. Na disseksie is elke vesel saggies gedompel in 3 μl lisebuffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) wat proteinase K en DNase-ensieme bevat om ongewenste proteïene en DNS te verwyder. Sellise en proteïen/DNS-verwydering is toe geïnisieer deur kort vortexing, die vloeistof in 'n mikrosentrifuge te spin en by kamertemperatuur (10 min) te inkubeer. Die lisaat is toe in 'n termiese sikliseerder (T100, Bio-Rad) by 37°C vir 5 min, 75°C vir 5 min, en toe onmiddellik by -80°C gestoor tot verdere verwerking.
Illumina-versoenbare poliadenileerde RNA-biblioteke is voorberei uit 2 µl miovesellisaat met behulp van die QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Gedetailleerde metodes kan in die vervaardiger se handleiding gevind word. Die proses begin met eerste-string cDNA-sintese deur omgekeerde transkripsie, waartydens unieke molekulêre identifiseerders (UMIs) en monsterspesifieke i1-strepieskodes ingebring word om die samevoeging van monsters te verseker en tegniese veranderlikheid tydens afwaartse verwerking te verminder. cDNA van 96 miovesels word dan saamgevoeg en gesuiwer met magnetiese krale, waarna RNA verwyder word en tweede-string-sintese uitgevoer word met behulp van ewekansige primers. Die biblioteek word gesuiwer met magnetiese krale, poelspesifieke i5/i7-etikette word bygevoeg en PCR word versterk. 'n Finale suiweringstap produseer Illumina-versoenbare biblioteke. Die kwaliteit van elke biblioteekpoel is beoordeel met behulp van die High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Gebaseer op Qubit-kwantifisering, is poele verder saamgevoeg teen ekwimolêre konsentrasies (2 nM). Die gevolglike poel is toe op 'n NovaSeq 6000-instrument in standaardmodus gesekwensieer met behulp van die NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nukleotiede) met 2 nM lading (4% PhiX).
Ons pyplyn is gebaseer op Lexogen se QuantSeq Pool data-analise pyplyn (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data is eers gedemultiplekseer met bcl2fastq2 (v2.20.0) gebaseer op die i7/i5 indeks. Lees 2 is toe gedemultiplekseer met idemux (v0.1.6) gebaseer op die i1 monster strepieskode en UMI volgordes is onttrek met umi_tools (v1.0.1). Lesings is toe met cutadapt (v3.4) in verskeie rondes afgesny om kort lesings (<20 in lengte) of lesings wat slegs uit adapter volgordes bestaan, te verwyder. Lesings is toe in lyn gebring met die menslike genoom met behulp van STAR (v2.6.0c) en BAM lêers is geïndekseer met SAMtools (v1.11). Duplikaat lesings is verwyder met behulp van umi_tools (v1.0.1). Laastens is belyningstelling uitgevoer met behulp van featureCounts in Subread (v2.0.3). Gehaltebeheer is uitgevoer met behulp van FastQC (v0.11.9) by verskeie tussenstadiums van die pyplyn.
Alle verdere bioinformatika-verwerking en -visualisering is in R (v4.2.3) uitgevoer, hoofsaaklik met behulp van die Seurat (v4.4.0) werkvloei. 83 Daarom is individuele UMI-waardes en metadata-matrikse in Seurat-objekte omskep. Gene wat in minder as 30% van alle vesels uitgedruk is, is verwyder. Lae-gehalte monsters is verwyder gebaseer op 'n minimum drempel van 1000 UMI-waardes en 1000 opgespoorde gene. Uiteindelik het 925 vesels alle kwaliteitskontrole-filterstappe geslaag. UMI-waardes is genormaliseer met behulp van die Seurat SCTransform v2-metode, 84 insluitend al 7418 opgespoorde kenmerke, en verskille tussen deelnemers is uitgeskakel. Alle relevante metadata kan gevind word in Aanvullende Datastel 28.
Plasingstyd: 10 September 2025