Dankie dat u Nature.com besoek het. Die weergawe van die blaaier wat u gebruik, het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste resultate beveel ons aan dat u 'n nuwer weergawe van u blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, vertoon ons die webwerf sonder stilering of JavaScript.
Mikrobiese groei in wonde manifesteer dikwels as biofilms, wat genesing belemmer en moeilik is om uit te roei. Nuwe silwerverbande beweer dat hulle wondinfeksies bestry, maar hul antibiofilm-effektiwiteit en infeksie-onafhanklike genesingseffekte is oor die algemeen onbekend. Deur in vitro en in vivo biofilmmodelle van Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa te gebruik, rapporteer ons die effektiwiteit van Ag1+ ioon-genererende verbande; Ag1+ verbande wat etileendiamientetraasynsuur en bensetoniumchloried (Ag1+/EDTA/BC) bevat, en verbande wat silwernitraat (Ag-oksisoute) bevat, wat Ag1+, Ag2+ en Ag3+ ione produseer om wondbiofilm en die effek daarvan op genesing te bestry. Ag1+ verbande het minimale effekte op wondbiofilm in vitro en in muise (C57BL/6j) gehad. In teenstelling hiermee het geoksigeneerde Ag-soute en Ag1+/EDTA/BC-verbande die aantal lewensvatbare bakterieë in biofilms in vitro aansienlik verminder en 'n beduidende vermindering in bakteriese en EPS-komponente in muiswondbiofilms getoon. Hierdie verbande het verskillende effekte op die genesing van biofilm-geïnfekteerde en nie-biofilm-geïnfekteerde wonde gehad, met geoksigeneerde soutverbande wat meer voordelige effekte op herepitelisering, wondgrootte en inflammasie het in vergelyking met kontrolebehandelings en ander silwerverbande. Die verskillende fisies-chemiese eienskappe van silwerverbande kan verskillende effekte op wondbiofilm en genesing hê, en dit moet in ag geneem word wanneer 'n verband vir die behandeling van biofilm-geïnfekteerde wonde gekies word.
Chroniese wonde word gedefinieer as "wonde wat nie ordelik en tydig deur die normale stadiums van genesing vorder nie"1. Chroniese wonde skep 'n sielkundige, sosiale en ekonomiese las vir pasiënte en die gesondheidsorgstelsel. Jaarlikse NHS-besteding aan die behandeling van wonde en gepaardgaande komorbiditeite word in 2017–182 op £8,3 miljard geraam. Chroniese wonde is tans ook 'n dringende probleem in die Verenigde State, met Medicare wat die jaarlikse koste van die behandeling van pasiënte met wonde op $28,1–$96,8 miljard3 skat.
Infeksie is 'n belangrike faktor wat wondgenesing voorkom. Infeksies manifesteer dikwels as biofilms, wat teenwoordig is in 78% van nie-genesende chroniese wonde. Biofilms vorm wanneer mikroörganismes onomkeerbaar aan oppervlaktes, soos wondoppervlaktes, geheg raak en kan aggregeer om ekstrasellulêre polimeer (EPS)-produserende gemeenskappe te vorm. Wondbiofilm word geassosieer met 'n verhoogde inflammatoriese reaksie wat lei tot weefselskade, wat genesing kan vertraag of voorkom4. Die toename in weefselskade kan deels te wyte wees aan verhoogde aktiwiteit van matriksmetalloproteïnases, kollagenase, elastase en reaktiewe suurstofspesies5. Boonop is inflammatoriese selle en biofilms self hoë verbruikers van suurstof en kan dus plaaslike weefselhipoksie veroorsaak, wat selle van die noodsaaklike suurstof uitput wat nodig is vir effektiewe weefselherstel6.
Volwasse biofilms is hoogs bestand teen antimikrobiese middels, wat aggressiewe strategieë vereis om biofilminfeksies te beheer, soos meganiese behandeling gevolg deur effektiewe antimikrobiese behandeling. Omdat biofilms vinnig kan regenereer, kan effektiewe antimikrobiese middels die risiko van hervorming na chirurgiese debridement verminder.
Silwer word toenemend in antimikrobiese verbande gebruik en word dikwels as 'n eerstelinie-behandeling vir chronies besmette wonde gebruik. Daar is baie kommersieel beskikbare silwerverbande, elk met 'n ander silwersamestelling, konsentrasie en basismatriks. Vooruitgang in silwerarmbande het gelei tot die ontwikkeling van nuwe silwerarmbande. Die metaalvorm van silwer (Ag0) is inert; om antimikrobiese doeltreffendheid te bereik, moet dit 'n elektron verloor om ioniese silwer (Ag1+) te vorm. Tradisionele silwerverbande bevat silwerverbindings of metaalsilwer wat, wanneer dit aan vloeistof blootgestel word, ontbind om Ag1+-ione te vorm. Hierdie Ag1+-ione reageer met die bakteriese sel en verwyder elektrone van strukturele komponente of kritieke prosesse wat nodig is vir oorlewing. Gepatenteerde tegnologie het gelei tot die ontwikkeling van 'n nuwe silwerverbinding, Ag-oksisoute (silwernitraat, Ag7NO11), wat in wondverbande ingesluit word. Anders as tradisionele silwer, produseer die ontbinding van suurstofbevattende soute toestande van silwer met hoër valensie (Ag1+, Ag2+ en Ag3+). In vitro-studies het getoon dat lae konsentrasies suurstofhoudende silwersoute meer effektief is as enkelioon-silwer (Ag1+) teen patogene bakterieë soos Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus en Escherichia coli8,9. Nog 'n nuwe tipe silwerverband bevat bykomende bestanddele, naamlik etileendiamientetraasynsuur (EDTA) en bensetoniumchloried (BC), wat na bewering biofilm-EPS teiken en sodoende die penetrasie van silwer in die biofilm verhoog. Hierdie nuwe silwertegnologieë bied nuwe maniere om wondbiofilms te teiken. Die impak van hierdie antimikrobiese middels op die wondomgewing en infeksie-onafhanklike genesing is egter belangrik om te verseker dat hulle nie 'n ongunstige wondomgewing skep of genesing vertraag nie. Kommer oor in vitro silwer-sitotoksisiteit is met verskeie silwerverbande10,11 aangemeld. In vitro-sitotoksisiteit het egter nog nie in in vivo-toksisiteit vertaal nie, en verskeie Ag1+-verbande het 'n goeie veiligheidsprofiel12 getoon.
Hier het ons die doeltreffendheid van karboksimetielsellulose-verbande wat nuwe silwerformulerings bevat teen wondbiofilm in vitro en in vivo ondersoek. Daarbenewens is die effekte van hierdie verbande op immuunresponse en genesing onafhanklik van infeksie geassesseer.
Alle verbande wat gebruik is, was kommersieel beskikbaar. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, VK) is 'n nie-antimikrobiese 100% karboksimetielsellulose (CMC) gelveselverband wat as die kontroleverband in hierdie studie gebruik is. Drie antimikrobiese CMC silwerverbande is geëvalueer, naamlik 3M Kerracel Ag-verband (3M, Knutsford, VK), wat 1.7 gewigs% geoksigeneerde silwersout (Ag7NO11) in hoër valens silwerione (Ag1+, Ag2+ en Ag3+) bevat. Tydens die ontbinding van Ag7NO11 word Ag1+, Ag2+ en Ag3+ ione in 'n verhouding van 1:2:4 gevorm. Aquacel Ag Extra-verband wat 1.2% silwerchloried (Ag1+) bevat (ConvaTec, Deeside, VK) 13 en Aquacel Ag + Extra-verband wat 1.2% silwerchloried (Ag1+), EDTA en bensetoniumchloried bevat (ConvaTec, Deeside, VK) 14.
Die stamme wat in hierdie studie gebruik is, was Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) en Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterieë is oornag gekweek in Muller-Hinton-bouillon (Oxoid, Altrincham, VK). Die oornagkultuur is toe 1:100 verdun in Mueller-Hinton-bouillon en 200 µl is op steriele 0.2 µm Whatman sikloporiemembrane (Whatman plc, Maidstone, VK) op Mueller-Hinton-agarplate (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Groot-Brittanje) uitgeplaat. Koloniale biofilmvorming by 37°C vir 24 uur. Hierdie koloniale biofilms is getoets vir logaritmiese krimping.
Sny die verband in 3 cm2 vierkantige stukke en maak dit vooraf nat met steriele gedeïoniseerde water. Plaas die verband oor die biofilm van die kolonie op die agarplaat. Elke 24 ha biofilm is verwyder, en lewensvatbare bakterieë binne die biofilm (KVE/ml) is gekwantifiseer deur seriële verdunning (10−1 tot 10−7) in Day-Angle neutralisasiebouillon (Merck-Millipore). Na 24 uur inkubasie by 37°C is standaardplaattellings op Mueller-Hinton agarplate uitgevoer. Elke behandeling en tydpunt is in drievoud uitgevoer, en plaattellings is vir elke verdunning herhaal.
Varkpensvel word binne 15 minute na slagting van vroulike Groot Wit varke verkry in ooreenstemming met uitvoerstandaarde van die Europese Unie. Die vel is geskeer en skoongemaak met alkoholdoeke, en toe vir 24 uur by -80°C gevries om die vel te devitaliseer. Na ontdooiing is 1 cm2 velstukke drie keer gewas met PBS, 0.6% natriumhipochloriet en 70% etanol vir 20 minute elke keer. Voordat die epidermis verwyder word, verwyder enige oorblywende etanol deur dit 3 keer in steriele PBS te was. Die vel is gekweek in 'n 6-putplaat met 'n 0.45-μm-dik nylonmembraan (Merck-Millipore) bo-op en 3 absorberende kussings (Merck-Millipore) wat 3 ml fetale beeserum (Sigma) bevat, aangevul met 10% Dulbecco se gemodifiseerde Eagle Medium (Dulbecco se Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Koloniale biofilms is gekweek soos beskryf vir biofilm-blootstellingsstudies. Nadat die biofilm vir 72 uur op die membraan gekweek is, is die biofilm met behulp van 'n steriele inokulasielus op die veloppervlak aangebring en die membraan is verwyder. Die biofilm is toe vir 'n bykomende 24 uur by 37°C op die vark se dermis geïnkubeer om die biofilm toe te laat om te volwasse en aan die vark se vel te kleef. Nadat die biofilm volwasse geword en geheg het, is 'n 1.5 cm2-verband, vooraf bevogtig met steriele gedistilleerde water, direk op die veloppervlak aangebring en vir 24 uur by 37°C geïnkubeer. Lewensvatbare bakterieë is gevisualiseer deur kleuring deur PrestoBlue-sel-lewensvatbaarheidsreagens (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, VK) eenvormig op die apikale oppervlak van elke eksplantaat aan te wend en dit vir 5 minute te inkubeer. Gebruik die Leica DFC425 digitale kamera om onmiddellik beelde op die Leica MZ8-mikroskoop vas te lê. Gebiede wat pienk gekleur is, is gekwantifiseer met behulp van Image Pro sagteware weergawe 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Skandeerelektronmikroskopie is uitgevoer soos hieronder beskryf.
Bakterieë wat oornag gekweek is, is 1:100 in Mueller-Hinton-bouillon verdun. 200 μl kultuur is by 'n steriele 0.2 μm Whatman sikloporiemembraan (Whatman, Maidstone, VK) gevoeg en op Mueller-Hinton-agar geplaas. Biofilmplate is vir 72 uur by 37°C geïnkubeer om volwasse biofilmvorming toe te laat.
Na 3 dae van biofilm-rypwording is 'n 3 cm2 vierkantige verband direk op die biofilm geplaas en vir 24 uur by 37°C geïnkubeer. Nadat die verband van die biofilm-oppervlak verwyder is, is 1 ml PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Waltham, MA) vir 20 sekondes by die oppervlak van elke biofilm gevoeg. Die oppervlaktes is gedroog voordat kleurveranderinge met 'n Nikon D2300 digitale kamera (Nikon UK Ltd., Kingston, VK) aangeteken is.
Berei oornagkulture voor op Mueller-Hinton-agar, dra individuele kolonies oor na 10 ml Mueller-Hinton-bouillon en inkubeer op 'n skudder by 37°C (100 rpm). Na oornag-inkubasie is die kultuur 1:100 verdun in Mueller-Hinton-bouillon en 300 µl is op 'n 0.2 µm sirkelvormige Whatman-sikloporiemembraan (Whatman International, Maidstone, VK) op Mueller-Hinton-agar geplaas en binne 72 uur by 37°C geïnkubeer. Die volwasse biofilm is op die wond aangebring soos hieronder beskryf.
Alle werk met diere is uitgevoer by die Universiteit van Manchester onder 'n projeklisensie wat goedgekeur is deur die Kantoor van Dierewelsyn en Etiese Hersiening (P8721BD27) en in ooreenstemming met riglyne wat deur die Departement van Binnelandse Sake gepubliseer is onder die 2012 hersiene ASPA. Alle outeurs het die aankomsriglyne nagekom. Agt weke oue C57BL/6j-muise (Envigo, Oxon, VK) is vir alle in vivo-studies gebruik. Muise is verdoof met isofluraan (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, VK) en hul dorsale oppervlaktes is geskeer en skoongemaak. Elke muis is toe 'n 2 × 6 mm eksisiewond gegee met behulp van 'n Stiefel-biopsiepons (Schuco International, Hertfordshire, VK). Vir biofilm-besmette wonde, dien 72-uur koloniale biofilm wat op die membraan gekweek is soos hierbo beskryf, onmiddellik na die besering toe op die dermale laag van die wond met behulp van 'n steriele inokulasielus en gooi die membraan weg. Een vierkante sentimeter verband word vooraf bevogtig met steriele water om 'n klam wondomgewing te handhaaf. Verbande is direk op elke wond aangebring en bedek met 3M Tegaderm-film (3M, Bracknell, VK) en Mastisol vloeibare kleefmiddel (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) wat om die rande aangebring is om addisionele adhesie te bied. Buprenorfien (Animalcare, York, VK) is teen 'n konsentrasie van 0.1 mg/kg as 'n pynstiller toegedien. Skot muise drie dae na besering uit met behulp van die Skedule 1-metode en verwyder, halveer en bêre die wondarea soos nodig.
Hematoksilien (ThermoFisher Scientific) en eosine (ThermoFisher Scientific) kleuring is volgens die vervaardiger se protokol uitgevoer. Wondarea en herepitelisering is gekwantifiseer met behulp van Image Pro sagteware weergawe 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Weefselseksies is in xileen (ThermoFisher Scientific, Loughborough, VK) ontwas, gerehidreer met 100–50% gegradeerde etanol, en kortliks in gedeïoniseerde water (ThermoFisher Scientific) gedompel. Immunohistochemie is uitgevoer met behulp van die VectaStain Elite ABC PK-6104-kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) volgens die vervaardiger se protokol. Primêre teenliggaampies teen neutrofiele NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) en makrofage Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, VK) is 1:100 in blokkeringsoplossing verdun en by die snyoppervlak gevoeg, gevolg deur 2 teenliggaampies Anti-, VectaStain ABC en Vector Nova Red Peroxidase (HRP) substraatkit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) en teengekleur met hematoksilien. Beelde is verkry met behulp van 'n Olympus BX43-mikroskoop en 'n Olympus DP73 digitale kamera (Olympus, Southend-on-Sea, VK).
Velmonsters is vir 24 uur by 4°C in 2.5% glutaraldehied en 4% formaldehied in 0.1 M HEPES (pH 7.4) gefikseer. Monsters is gedehidreer met behulp van gegradeerde etanol en in CO2 gedroog met behulp van 'n Quorum K850 kritieke punt droër (Quorum Technologies Ltd, Loughton, VK) en met 'n goud-palladium allooi gesputter met behulp van 'n Quorum SC7620 mini sputterer/gloei-ontladingstelsel. Monsters is afgebeeld met behulp van 'n FEI Quanta 250 skandeerelektronmikroskoop (ThermoFisher Scientific) om die sentrale punt van die wond te visualiseer.
Toto-1-jodied (2 μM) is op die uitgesnyde muiswondoppervlak aangewend en vir 5 minute by 37 °C (ThermoFisher Scientific) geïnkubeer en met Syto-60 (10 μM) by 37 °C (ThermoFisher Scientific) behandel. 15-minuut Z-stapelbeelde is met 'n Leica TCS SP8 geskep.
Biologiese en tegniese replikaatdata is getabuleer en geanaliseer met behulp van Graphpad Prism V9 sagteware (GraphPad Software, La Jolla, CA). Eenrigting-variansie-analise met veelvuldige vergelykings met behulp van Dunnett se post hoc-toets is gebruik om te toets vir verskille tussen elke behandeling en die nie-antimikrobiese kontroleverband. 'n P-waarde <0.05 is as beduidend beskou.
Die doeltreffendheid van silwerjel-veselverbande is eers in vitro geassesseer teen biofilmkolonies van Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa. Silwerverbande bevat verskillende formules van silwer: tradisionele silwerverbande produseer Ag1+-ione; silwerverbande, wat Ag1+-ione kan produseer na die byvoeging van EDTA/BC, kan die biofilmmatriks vernietig en bakterieë aan silwer blootstel onder die antibakteriese effek van silwerione15 en verbande wat geoksigeneerde Ag-soute bevat wat Ag1+-, Ag2+- en Ag3+-ione produseer. Die doeltreffendheid daarvan is vergelyk met 'n nie-antimikrobiese beheerverband gemaak van gegelde vesels. Oorblywende lewensvatbare bakterieë binne die biofilm is elke 24 uur vir 8 dae geassesseer (Figuur 1). Op dag 5 is die biofilm herinkuleer met 3.85 × 105S. Staphylococcus aureus of 1.22×105P. aeruginosa om biofilmherstel te bepaal. In vergelyking met nie-antimikrobiese beheerverbande, het Ag1+-verbande 'n minimale effek op bakteriële lewensvatbaarheid in Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa biofilms oor 5 dae gehad. In teenstelling hiermee was verbande wat geoksigeneerde Ag en Ag1+ + EDTA/BC-soute bevat, effektief in die doodmaak van bakterieë binne die biofilm binne 5 dae. Na herhaalde inenting met planktoniese bakterieë op dag 5, is geen herstel van die biofilm waargeneem nie (Fig. 1).
Kwantifisering van lewensvatbare bakterieë in Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa biofilms na behandeling met silwerverbande. Biofilmkolonies van Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa is behandel met silwerverbande of nie-antimikrobiese beheerverbande, en die aantal oorblywende lewensvatbare bakterieë is elke 24 uur bepaal. Na 5 dae is die biofilm herinkuleer met 3.85×105S. Staphylococcus aureus of 1.22×105P. Kolonies van die bakterioplankton Pseudomonas aeruginosa is individueel gevorm om biofilmherstel te bepaal. Grafieke toon gemiddelde +/- standaardfout.
Om die effek van silwerverbande op biofilm-lewensvatbaarheid te visualiseer, is verbande op volwasse biofilms wat ex vivo op varkvel gekweek is, aangebring. Na 24 uur word die verband verwyder en die biofilm gekleur met 'n blou reaktiewe kleurstof, wat deur lewende bakterieë tot 'n pienk kleur gemetaboliseer word. Biofilms wat met kontroleverbande behandel is, was pienk, wat die teenwoordigheid van lewensvatbare bakterieë binne die biofilm aandui (Figuur 2A). In teenstelling hiermee was die biofilm wat met die Ag-oksisolverband behandel is, hoofsaaklik blou, wat aandui dat die oorblywende bakterieë op die oppervlak van die vark se vel nie-lewensvatbare bakterieë was (Figuur 2B). Gemengde blou en pienk kleur is waargeneem in biofilms wat met Ag1+-bevattende verbande behandel is, wat die teenwoordigheid van lewensvatbare en nie-lewensvatbare bakterieë binne die biofilm aandui (Figuur 2C), terwyl EDTA/BC-verbande wat Ag1+ bevat, oorwegend blou was met 'n paar pienk kolle, wat areas aandui wat nie deur die silwerverband beïnvloed is nie (Figuur 2D). Kwantifisering van aktiewe (pienk) en onaktiewe (blou) areas het getoon dat die kontrolekolletjie 75% aktief was (Figuur 2E). Ag1+ + EDTA/BC-verbande het soortgelyk presteer as geoksigeneerde Ag-soutverbande, met oorlewingsyfers van onderskeidelik 13% en 14%. Die Ag1+-verband het ook bakteriële lewensvatbaarheid met 21% verminder. Hierdie biofilms is toe waargeneem met behulp van skandeerelektronmikroskopie (SEM). Na behandeling met die kontroleverband en die Ag1+-verband is 'n laag Pseudomonas aeruginosa waargeneem wat die varkvel bedek (Figuur 2F,H), terwyl na behandeling met die Ag1+-verband min bakteriese selle gevind is en min bakteriese selle daaronder. Kollageenvesels kan beskou word as die weefselstruktuur van varkvel (Figuur 2G). Na behandeling met Ag1+ + EDTA/BC-verband was bakteriese plate en onderliggende kollageenveselplate sigbaar (Figuur 2I).
Visualisering van Pseudomonas aeruginosa-biofilm na behandeling met silwerverband. (A–D) Bakteriële lewensvatbaarheid in Pseudomonas aeruginosa-biofilms wat op varkvel gekweek is, is gevisualiseer met behulp van PrestoBlue-lewensvatbaarheidskleurstof 24 uur na behandeling met silwerverbande of nie-antimikrobiese beheerverbande. Lewende bakterieë is pienk, nie-lewensvatbare bakterieë en varkvel is blou. (E) Kwantifisering van Pseudomonas aeruginosa-biofilms wat op varkvel gekweek is (pienk kol) met behulp van skandeerelektronmikroskopie Image Pro weergawe 10 (FI) en behandel met 'n silwerverband of 'n nie-antimikrobiese beheerverband vir 24 uur. SEM-skaalbalk = 5 µm. (J–M) Koloniale biofilms het op filters gegroei en is gekleur met PrestoBlue-reaktiewe kleurstof na 24 uur se inkubasie met silwerverbande.
Om te bepaal of noue kontak tussen die verbande en die biofilms die doeltreffendheid van die verbande beïnvloed het, is koloniale biofilms wat op 'n plat oppervlak geplaas is, vir 24 uur met die verbande behandel en toe met reaktiewe kleurstowwe gekleur. Die onbehandelde biofilm was donkerpienk van kleur (Figuur 2J). In teenstelling met biofilms wat behandel is met verbande wat geoksigeneerde Ag-soute bevat (Figuur 2K), het biofilms wat behandel is met verbande wat Ag1+ of Ag1+ + EDTA/BC bevat, bande van pienk vlekking getoon (Figuur 2L,M). Hierdie pienk kleur dui op die teenwoordigheid van lewensvatbare bakterieë en word geassosieer met die hegtingarea binne die verband. Hierdie ingenaaide areas skep dooie ruimtes wat bakterieë binne die biofilm toelaat om te oorleef.
Om die doeltreffendheid van silwerverbande in vivo te evalueer, is voldikte uitgesnyde wonde van muise wat met volwasse S. aureus- en P. aeruginosa-biofilms besmet is, behandel met nie-antimikrobiese beheerverbande of silwerverbande. Na 3 dae se behandeling het makroskopiese beeldanalise kleiner wondgroottes getoon wanneer dit met geoksigeneerde soutverbande behandel is in vergelyking met nie-antimikrobiese beheerverbande en ander silwerverbande (Figuur 3A-H). Om hierdie waarnemings te bevestig, is wonde geoes en wondarea en herepitelisering is gekwantifiseer op hematoksilien- en eosine-gekleurde weefselsnitte met behulp van Image Pro-sagteware weergawe 10 (Figuur 3I-L).
Die effek van silwerverbande op die wondoppervlak en herepitelisasie van wonde wat met biofilms besmet is. (A–H) Klein selle besmet met biofilms van Pseudomonas aeruginosa (A–D) en Staphylococcus aureus (E–H) na drie dae se behandeling met 'n nie-antimikrobiese beheerverband, 'n geoksigeneerde Ag-soutverband, 'n Ag1+-verband en 'n Ag1+-verband. Verteenwoordigende makroskopiese beelde. Wonde van muise met Ag1+ + EDTA/BC-verband. (IL) Verteenwoordigende Pseudomonas aeruginosa-infeksie, histologiese snitte gekleur met hematoksilien en eosien, gebruik om wondoppervlakte en epiteelregenerasie te kwantifiseer. Kwantifisering van wondoppervlakte (M, O) en persentasie herepitelisasie (N, P) van wonde wat met Pseudomonas aeruginosa (M, N) en Staphylococcus aureus (O, P) biofilms besmet is (per behandelingsgroep n = 12). Grafieke toon gemiddelde +/- standaardfout. * beteken p = < 0.05 ** beteken p = < 0.01; Makroskopiese skaal = 2.5 mm, histologiese skaal = 500 µm.
Kwantifisering van wondoppervlakte in wonde wat met Pseudomonas aeruginosa-biofilm besmet is (Figuur 3M) het getoon dat wonde wat met Ag-oksisoute behandel is, 'n gemiddelde wondgrootte van 2.5 mm2 gehad het, terwyl die nie-antimikrobiese kontroleverband 'n gemiddelde wondgrootte van 3.1 mm2 gehad het, wat nie waar is nie. het statistiese betekenisvolheid bereik (Figuur 3M). p = 0.423). Wonde wat met Ag1+ of Ag1+ + EDTA/BC behandel is, het geen vermindering in wondoppervlakte getoon nie (onderskeidelik 3.1 mm2 en 3.6 mm2). Behandeling met geoksigeneerde Ag-soutverband het herepitelisering in 'n groter mate bevorder as die nie-antimikrobiese kontroleverband (onderskeidelik 34% en 15%; p = 0.029) en Ag1+ of Ag1+ + EDTA/BC (onderskeidelik 10% en 11%) (Figuur 3N). . , onderskeidelik).
Soortgelyke tendense in wondoppervlakte en epiteelregenerasie is waargeneem in wonde wat met S. aureus-biofilms besmet is (Figuur 3O). Verbande wat geoksigeneerde silwersoute bevat, het die wondoppervlakte (2.0 mm2) met 23% verminder in vergelyking met die kontrole nie-antimikrobiese verband (2.6 mm2), hoewel hierdie vermindering nie beduidend was nie (p = 0.304) (Fig. 3O). Daarbenewens was die wondoppervlakte in die Ag1+-behandelingsgroep effens verminder (2.4 mm2), terwyl die wond wat met Ag1+ + EDTA/BC-verband behandel is, nie die wondoppervlakte (2.9 mm2) verminder het nie. Suurstofsoute van Ag het ook herepitelisering van wonde wat met S. aureus-biofilm (31%) besmet is, in 'n groter mate bevorder as dié wat met nie-antimikrobiese kontroleverbande behandel is (12%, p = 0.003) (Figuur 3P). Ag1+-verband (16%, p = 0.903) en Ag+1 + EDTA/BC-verband (14%, p = 0.965) het vlakke van epiteelregenerasie soortgelyk aan die kontrole getoon.
Om die effek van silwerverbande op die biofilmmatriks te visualiseer, is Toto 1- en Syto 60-jodiedkleuring uitgevoer (Fig. 4). Toto 1-jodied is 'n selverdringbare kleurstof wat gebruik kan word om ekstrasellulêre nukleïensure, wat volop is in die EPS van biofilms, akkuraat te visualiseer. Syto 60 is 'n selverdringbare kleurstof wat as 'n teenkleurstof gebruik word16. Waarnemings van Toto 1- en Syto 60-jodied in wonde wat met biofilms van Pseudomonas aeruginosa (Figuur 4A-D) en Staphylococcus aureus (Figuur 4I-L) ingeënt is, het getoon dat na 3 dae se verbandbehandeling, EPS in die biofilm aansienlik verminder is. Dit bevat suurstofhoudende soute Ag en Ag1+ + EDTA/BC. Ag1+-verbande sonder bykomende antibiofilmkomponente het selvrye DNS in wonde wat met Pseudomonas aeruginosa ingeënt is, aansienlik verminder, maar was minder effektief in wonde wat met Staphylococcus aureus ingeënt is.
In vivo-beelding van wondbiofilm na 3 dae se behandeling met kontrole- of silwerverbande. Konfokale beelde van Pseudomonas aeruginosa (A–D) en Staphylococcus aureus (I–L) gekleur met Toto 1 (groen) om ekstrasellulêre nukleïensure, 'n komponent van ekstrasellulêre biofilmpolimere, te visualiseer. Om intrasellulêre nukleïensure te kleur, gebruik Syto 60 (rooi). sure. P. Skandeerelektronmikroskopie van wonde besmet met Pseudomonas aeruginosa (E–H) en Staphylococcus aureus (M–P) biofilms na 3 dae se behandeling met kontrole- en silwerverbande. SEM-skaalbalk = 5 µm. Konfokale beeldskaalbalk = 50 µm.
Skandeerelektronmikroskopie het getoon dat muise wat met biofilmkolonies van Pseudomonas aeruginosa (Figuur 4E-H) en Staphylococcus aureus (Figuur 4M-P) ingeënt is, aansienlik minder bakterieë in hul wonde gehad het na 3 dae se behandeling met slegs silwerverbande.
Om die effek van silwerverbande op wondinflammasie in biofilm-besmette muise te evalueer, is gedeeltes van biofilm-besmette wonde wat vir 3 dae met kontrole- of silwerverbande behandel is, immunohistochemies gekleur met behulp van teenliggaampies spesifiek vir neutrofiele en makrofage. Kwantitatiewe bepaling van neutrofiele en makrofage intern. granulasieweefsel. Figuur 5). Alle silwerverbande het die aantal neutrofiele en makrofage in wonde wat met Pseudomonas aeruginosa besmet is, verminder in vergelyking met nie-antimikrobiese kontroleverbande na drie dae se behandeling. Behandeling met die geoksigeneerde silwersoutverband het egter 'n groter vermindering in neutrofiele (p = <0.0001) en makrofage (p = <0.0001) tot gevolg gehad in vergelyking met ander silwerverbande wat getoets is (Figuur 5I,J). Alhoewel Ag1+ + EDTA/BC 'n groter effek op wondbiofilm gehad het, het dit neutrofiel- en makrofaagvlakke in 'n mindere mate verminder as die Ag1+-verband. Matige wonde wat met S. aureus-biofilm besmet is, is ook waargeneem na verband met Ag (p = <0.0001), Ag1+ (p = 0.0008) en Ag1++ EDTA/BC (p = 0.0043) oksisole in vergelyking met die kontrole. Soortgelyke tendense word waargeneem vir neutropenieverband (Fig. 5K). Slegs die geoksigeneerde Ag-soutverband het egter 'n beduidende vermindering in die aantal makrofage in granulasieweefsel getoon in vergelyking met die kontrole in wonde wat met S. aureus-biofilms besmet is (p = 0.0339) (Figuur 5L).
Neutrofiele en makrofage is gekwantifiseer in wonde wat besmet is met Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus biofilms na 3 dae van behandeling met nie-antimikrobiese beheer of silwerverbande. Neutrofiele (AD) en makrofage (EH) is gekwantifiseer in weefselseksies gekleur met teenliggaampies spesifiek vir neutrofiele of makrofage. Kwantifisering van neutrofiele (I en K) en makrofage (J en L) in wonde wat besmet is met Pseudomonas aeruginosa (I en J) en Staphylococcus aureus (K & L) biofilms. N = 12 per groep. Grafieke toon gemiddelde +/- standaardfout, betekeniswaardes in vergelyking met nie-antibakteriese beheerverband, * beteken p = < 0.05, ** beteken p = < 0.01; *** beteken p = < 0.001; dui p = <0.0001 aan).
Ons het toe die effek van silwerverbande op infeksie-onafhanklike genesing beoordeel. Nie-geïnfekteerde eksisiewonde is vir 3 dae behandel met 'n nie-antimikrobiese kontroleverband of 'n silwerverband (Figuur 6). Onder die silwerverbande wat getoets is, het slegs wonde wat met die suurstofhoudende soutverband behandel is, kleiner op makroskopiese beelde gelyk as wonde wat met die kontrolegroep behandel is (Figuur 6A-D). Kwantifisering van wondoppervlakte met behulp van histologiese analise het getoon dat die gemiddelde wondoppervlakte na behandeling met die Ag-oksisolverband 2,35 mm2 was in vergelyking met 2,96 mm2 vir wonde wat met die kontrolegroep behandel is, maar hierdie verskil het nie statistiese beduidendheid bereik nie (p = 0,488) (Fig. 6I). In teenstelling hiermee is geen vermindering in wondoppervlakte waargeneem na behandeling met Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) of Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) verbande in vergelyking met die kontrolegroep nie. Verhoogde epiteelregenerasie is waargeneem met die Ag-oksisolverband in vergelyking met die kontrolegroep (onderskeidelik 30% teenoor 22%), hoewel dit nie betekenisvol was nie (p = 0.067). Dit is egter nogal betekenisvol en bevestig vorige resultate. 'n Verband met oksisole bevorder herepitelisering. -Epitelisering van onbesmette wonde17. In teenstelling hiermee het behandeling met Ag1+ of Ag1+ + EDTA/BC-verbande geen effek gehad nie of 'n afname in herepitelisering getoon in vergelyking met die kontrolegroep.
Effek van silwer wondverband op wondgenesing in onbesmette muise met volledige reseksie. (AD) Verteenwoordigende makroskopiese beelde van wonde na drie dae se behandeling met 'n nie-antimikrobiese kontroleverband en 'n silwerverband. (EH) Verteenwoordigende wondsnitte gekleur met hematoksilien en eosine. Kwantifisering van wondarea (I) en persentasie herepitelisering (J) is bereken vanaf histologiese snitte by die middelpunt van die wond met behulp van beeldanaliseprogrammatuur (n = 11–12 per behandelingsgroep). Grafieke toon gemiddelde +/- standaardfout. * gemiddeldes p = <0.05.
Silwer het 'n lang geskiedenis van gebruik as 'n antimikrobiese terapie in wondgenesing, maar die vele verskillende formulasies en afleweringsmetodes kan lei tot verskille in antimikrobiese doeltreffendheid 18. Boonop word die antibiofilm-eienskappe van spesifieke silwer-afleweringstelsels nie ten volle verstaan nie. Alhoewel die gasheer se immuunrespons relatief effektief is teen planktoniese bakterieë, is dit oor die algemeen minder effektief teen biofilms19. Planktoniese bakterieë word geredelik deur makrofage gefagositeer, maar binne biofilms veroorsaak geaggregeerde selle bykomende probleme deur die gasheer se reaksie te beperk tot die mate dat immuunselle apoptose kan ondergaan en pro-inflammatoriese faktore kan vrystel om die immuunrespons20 te verbeter. Daar is waargeneem dat sommige leukosiete biofilms kan binnedring21, maar nie in staat is om bakterieë te fagositeer sodra hierdie verdediging gekompromitteer is22 nie. 'n Holistiese benadering moet gebruik word om die gasheer se immuunrespons teen wondbiofilminfeksie te ondersteun. Wonddebridering kan die biofilm fisies ontwrig en die meeste van die biolas verwyder, maar die gasheer se immuunrespons kan ondoeltreffend wees teen die oorblywende biofilm, veral as die gasheer se immuunrespons gekompromitteer is. Dus kan antimikrobiese terapieë soos silwerverbande die gasheer se immuunrespons ondersteun en biofilminfeksies uitskakel. Samestelling, konsentrasie, oplosbaarheid en afleweringssubstraat kan die antimikrobiese doeltreffendheid van silwer beïnvloed. In onlangse jare het vooruitgang in silwerverwerkingstegnologie hierdie verbande meer effektief gemaak9,23. Namate silwerverbandtegnologie vorder, is dit belangrik om die doeltreffendheid van hierdie verbande in die beheer van wondinfeksie te verstaan en, nog belangriker, die impak van hierdie kragtige vorme van silwer op die wondomgewing en genesing.
In hierdie studie het ons die doeltreffendheid van twee gevorderde silwerverbande vergelyk met konvensionele silwerverbande wat Ag1+-ione teen biofilms produseer deur verskillende in vitro- en in vivo-modelle te gebruik. Ons het ook die effek van hierdie verbande op die wondomgewing en infeksie-onafhanklike genesing beoordeel. Om die invloed van die toedieningsmatriks te minimaliseer, was alle silwerverbande wat getoets is, saamgestel uit karboksimetielsellulose.
Ons voorlopige evaluering van hierdie silwerverbande teen koloniale biofilms van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus toon dat, anders as tradisionele Ag1+-verbande, twee gevorderde silwerverbande, Ag1+ + EDTA/BC en geoksigeneerde Ag-soute, effektief is teen 5. Dit maak biofilmbakterieë effektief binne 'n paar dae dood. Boonop voorkom hierdie verbande die hervorming van biofilm na herhaalde blootstelling aan planktoniese bakterieë. Die Ag1+-verband het silwerchloried bevat, dieselfde silwerverbinding en basismatriks as Ag1+ + EDTA/BC, en het 'n beperkte effek op bakteriese lewensvatbaarheid binne die biofilm oor dieselfde tydperk gehad. Die waarneming dat 'n Ag1+ + EDTA/BC-verband meer effektief teen biofilm was as 'n Ag1+-verband wat uit dieselfde matriks en 'n silwerverbinding bestaan, ondersteun die idee dat bykomende bestanddele nodig is om die effektiwiteit van silwerchloried teen biofilm te verhoog, soos elders gerapporteer is15. Hierdie resultate ondersteun die idee dat BC en EDTA 'n bykomende rol speel wat bydra tot die algehele verbanddoeltreffendheid en dat die afwesigheid van hierdie komponent in Ag1+-verbande moontlik bygedra het tot die mislukking om in vitro-doeltreffendheid te demonstreer. Ons het gevind dat geoksigeneerde Ag-soutverbande wat Ag2+- en Ag3+-ione produseer, sterker antibakteriese doeltreffendheid getoon het as Ag1+ en op vlakke soortgelyk aan Ag1+ + EDTA/BC. As gevolg van die hoë redokspotensiaal is dit egter onduidelik hoe lank Ag3+-ione aktief en effektief bly teen wondbiofilms en verdien dus verdere studie. Daarbenewens is daar baie verskillende verbande wat Ag1+-ione genereer wat nie in hierdie studie getoets is nie. Hierdie verbande bestaan uit verskillende silwerverbindings, konsentrasies en basismatrikse, wat die aflewering van Ag1+-ione en hul doeltreffendheid teen biofilms kan beïnvloed. Dit is ook die moeite werd om daarop te let dat daar baie verskillende in vitro- en in vivo-modelle is wat gebruik word om die doeltreffendheid van wondverbande teen biofilms te evalueer. Die tipe model wat gebruik word, sowel as die sout- en proteïeninhoud van die media wat in hierdie modelle gebruik word, sal die doeltreffendheid van die verband beïnvloed. In ons in vivo-model het ons die biofilm in vitro toegelaat om te volwasse en dit dan na die dermale oppervlak van die wond oorgedra. Die gasheermuis se immuunrespons is relatief effektief teen planktoniese bakterieë wat op die wond toegedien word, waardeur 'n biofilm gevorm word soos die wond genees. Die byvoeging van volwasse biofilm tot 'n wond beperk die doeltreffendheid van die gasheer se immuunrespons op biofilmvorming deur die volwasse biofilm toe te laat om homself binne die wond te vestig voordat genesing kan begin. Dus laat ons model ons toe om die doeltreffendheid van antimikrobiese verbande op volwasse biofilms te evalueer voordat wonde begin genees.
Ons het ook gevind dat die pasvorm van die verband die doeltreffendheid van silwerverbande op in vitro-gekweekte biofilms en varkvel beïnvloed het. Noue kontak met die wond word as krities beskou vir die antimikrobiese doeltreffendheid van die verband24,25. Verbande wat geoksigeneerde Ag-soute bevat, was in noue kontak met volwasse biofilms, wat gelei het tot 'n beduidende vermindering in die aantal lewensvatbare bakterieë binne die biofilm na 24 uur. In teenstelling hiermee, wanneer dit met Ag1+ en Ag1+ + EDTA/BC-verbande behandel is, het beduidende getalle lewensvatbare bakterieë oorgebly. Hierdie verbande bevat hegtings langs die hele lengte van die verband, wat dooie ruimtes skep wat noue kontak met die biofilm voorkom. In ons in vitro-studies het hierdie nie-kontakareas die doodmaak van lewensvatbare bakterieë binne die biofilm verhoed. Ons het bakteriese lewensvatbaarheid eers na 24 uur se behandeling beoordeel; Met verloop van tyd, soos die verband meer versadig raak, kan daar minder dooie ruimte wees, wat die area vir hierdie lewensvatbare bakterieë verminder. Dit beklemtoon egter die belangrikheid van die samestelling van die verband, nie net die tipe silwer in die verband nie.
Alhoewel in vitro-studies nuttig is om die doeltreffendheid van verskillende silwertegnologieë te vergelyk, is dit ook belangrik om die effekte van hierdie verbande op biofilms in vivo te verstaan, waar gasheerweefsel en immuunresponse bydra tot die doeltreffendheid van die verbande teen biofilms. Die effek van hierdie verbande op wondbiofilms is waargeneem deur middel van skandeerelektronmikroskopie en EPS-kleuring van die biofilm met behulp van intrasellulêre en ekstrasellulêre DNA-kleurstowwe. Ons het gevind dat na 3 dae se behandeling alle verbande effektief was in die vermindering van selvrye DNA in biofilm-besmette wonde, maar die Ag1+-verband was minder effektief in Staphylococcus aureus-besmette wonde. Skandeerelektronmikroskopie het ook getoon dat aansienlik minder bakterieë teenwoordig was in wonde wat met die silwerverbande behandel is, hoewel dit meer prominent was met die geoksigeneerde Ag-soutverband en die Ag1+ + EDTA/BC-verband in vergelyking met die Ag1+-verband. Hierdie data toon dat die silwerverbande wat getoets is, wisselende grade van impak op die biofilmstruktuur gehad het, maar geeneen van die silwerverbande kon die biofilm uitwis nie, wat die behoefte aan 'n holistiese benadering tot die behandeling van wondbiofilminfeksies ondersteun; die gebruik van silwer armbande. Behandeling word voorafgegaan deur fisiese debridement om die meeste van die biofilm te verwyder.
Chroniese wonde is dikwels in 'n toestand van ernstige inflammasie, met oortollige inflammatoriese selle wat vir 'n lang tydperk in die wondweefsel bly, wat weefselskade veroorsaak en die suurstof wat nodig is vir doeltreffende sellulêre metabolisme en funksie in die wond uitput26. Biofilms vererger hierdie vyandige wondomgewing deur genesing op 'n verskeidenheid maniere negatief te beïnvloed, insluitend die inhibisie van selproliferasie en -migrasie en die aktivering van pro-inflammatoriese sitokiene27. Namate silwerverbande meer effektief word, is dit belangrik om die impak wat hulle op die wondomgewing en genesing het, te verstaan.
Interessant genoeg, alhoewel alle silwerverbande die biofilmsamestelling beïnvloed het, het slegs geoksigeneerde silwersoutverbande die herepitelisering van hierdie besmette wonde verhoog. Hierdie data ondersteun ons vorige bevindinge17 en dié van Kalan et al. (2017)28, wat goeie veiligheids- en toksisiteitsprofiele van geoksigeneerde silwersoute getoon het, aangesien laer konsentrasies silwer effektief teen biofilms was.
Ons huidige studie beklemtoon die verskille in silwertegnologie tussen antimikrobiese silwerverbande en die impak van hierdie tegnologie op die wondomgewing en infeksie-onafhanklike genesing. Hierdie resultate verskil egter van vorige studies wat toon dat Ag1+ + EDTA/BC-verband die genesingsparameters van beseerde konynore in vivo verbeter het. Dit kan egter wees as gevolg van verskille in diermodelle, meettye en bakteriese toedieningsmetodes29. In hierdie geval is wondmetings 12 dae na die besering geneem om die aktiewe bestanddele van die verband toe te laat om oor 'n langer tydperk op die biofilm in te werk. Dit word ondersteun deur 'n studie wat getoon het dat klinies besmette beenulkusse wat met Ag1+ + EDTA/BC behandel is, aanvanklik in grootte toegeneem het na een week van behandeling, en dan oor die volgende 3 weke van behandeling met Ag1+ + EDTA/BC en binne 4 weke na die gebruik van nie-antimikrobiese middels. CMC-verbande om die grootte van ulkusse te verminder30.
Sekere vorme en konsentrasies van silwer is voorheen in vitro as sitotoksies aangetoon 11, maar hierdie in vitro-resultate vertaal nie altyd in nadelige effekte in vivo nie. Boonop het vooruitgang in silwertegnologie en 'n beter begrip van silwerverbindings en -konsentrasies in verbande gelei tot die ontwikkeling van baie veilige en effektiewe silwerverbande. Namate silwerverbandtegnologie egter vorder, is dit belangrik om die impak van hierdie verbande op die wondomgewing te verstaan31,32,33. Daar is voorheen berig dat die verhoogde tempo van herepitelisering ooreenstem met 'n verhoogde proporsie anti-inflammatoriese M2-makrofage in vergelyking met die pro-inflammatoriese M1-fenotipe. Dit is opgemerk in 'n vorige muismodel waar silwerhidrogel-wondverbande vergelyk is met silwersulfadiasien en nie-antimikrobiese hidrogels34.
Chroniese wonde kan oormatige inflammasie toon en daar is waargeneem dat die teenwoordigheid van oortollige neutrofiele nadelig vir wondgenesing kan wees35. In 'n studie in neutrofiel-uitgeputte muise het die teenwoordigheid van neutrofiele herepitelisering vertraag. Die teenwoordigheid van oortollige neutrofiele lei tot hoë vlakke van proteases en reaktiewe suurstofspesies, soos superoksied en waterstofperoksied, wat geassosieer word met chroniese en stadig genesende wonde37,38. Net so kan 'n toename in makrofaaggetalle, indien onbeheerbaar, lei tot vertraagde wondgenesing39. Hierdie toename is veral belangrik as makrofage nie in staat is om oor te skakel van 'n pro-inflammatoriese fenotipe na 'n pro-genesende fenotipe nie, wat daartoe lei dat wonde nie die inflammatoriese fase van genesing verlaat nie40. Ons het 'n afname in neutrofiele en makrofage in biofilm-besmette wonde waargeneem na 3 dae van behandeling met alle silwerverbande, maar die afname was meer uitgesproke met suurstofryke soutverbande. Hierdie afname kan 'n direkte gevolg wees van die immuunrespons op silwer, 'n reaksie op verminderde biolas, of die wond wat in 'n later stadium van genesing is en dus immuunselle in die wond verminder word. Die vermindering van die aantal inflammatoriese selle in die wond kan 'n omgewing handhaaf wat bevorderlik is vir wondgenesing. Die werkingsmeganisme van hoe Ag-oksisoute infeksie-onafhanklike genesing bevorder, is onduidelik, maar die vermoë van Ag-oksisoute om suurstof te produseer en skadelike vlakke van waterstofperoksied, 'n mediator van inflammasie, te vernietig, kan dit verklaar en vereis verdere studie17.
Chroniese nie-genesende besmette wonde hou 'n probleem in vir beide dokters en pasiënte. Alhoewel baie verbande antimikrobiese doeltreffendheid beweer, fokus navorsing selde op ander sleutelfaktore wat die wondmikro-omgewing beïnvloed. Hierdie studie toon dat verskillende silwertegnologieë verskillende antimikrobiese doeltreffendheid en, belangrik, verskillende effekte op die wondomgewing en genesing het, onafhanklik van infeksie. Alhoewel hierdie in vitro- en in vivo-studies die doeltreffendheid van hierdie verbande in die behandeling van wondinfeksies en die bevordering van genesing toon, is gerandomiseerde beheerde proewe nodig om die doeltreffendheid van hierdie verbande in die kliniek te evalueer.
Die datastelle wat tydens die huidige studie gebruik en/of geanaliseer is, is op redelike versoek by die ooreenstemmende outeur beskikbaar.
Plasingstyd: 15 Julie 2024